3D-видеонаблюдение в режиме реального времени фиксирует поведение вируса на ранней стадии инфекции

Одной из первых линий защиты организма от вирусной инфекции служат слои тесно примыкающих друг к другу эпителиальных клеток, выстилающих дыхательные пути и кишечник и покрытых слизью. Исследование того, как вирусам удается преодолеть эту защиту, представляется нетривиальной задачей. Самые ранние моменты взаимодействия вируса с клеткой, происходящие еще до начала заражения, сложно проследить с помощью существующих методов микроскопии.

Существующие методы отслеживания одиночных частиц (single-particle tracking, SPT) позволили описать механизмы взаимодействия вириона с клеточной поверхностью. Однако проследить поведение вирионов во внеклеточном матриксе с достаточной степенью визуализации не представлялось возможным, так как они погружены слишком глубоко и движутся слишком быстро для SRT.

Еще больше усложняет задачу визуализации то, что вирусы в сотни раз меньше клеток, которые они заражают. «Под микроскопом это похоже на попытку сфотографировать человека, стоящего перед небоскребом. Вы не можете получить весь небоскреб и увидеть человека перед ним на одном снимке», — поясняет Кортни Джонсон, участница команды Университета Дьюка (США), которая разработала способ записи поведения вируса при приближении к клетке-мишени в формате 3D-видео в реальном времени. Метод назвали 3D-TrIm. Он позволяет отследить траекторию единичной вирусной частицы на фоне трехмерного изображения слоя живых клеток. Работа опубликована в Nature Methods.

3D-TrIm объединяет два «микроскопа» в одном. Первый «микроскоп», реализованный на основе технологии трехмерного активного отслеживания отдельных молекул в режиме реального времени (3D-SMART), фиксируется на быстро движущемся вирусе, проводя лазером вокруг него десятки тысяч раз в секунду, чтобы вычислить и обновить его положение. Вирусная частица должна быть связана с флуоресцентной меткой. Пока вирус подпрыгивает и кувыркается во внеклеточном матриксе, система постоянно настраивается, чтобы удерживать его в фокусе. В настоящее время ученые могут отслеживать вирус только в течение нескольких минут, затем метка исчезает.

Второй «микроскоп» использует технологию быстрого трехмерного захвата с вертикальным фокальным сканированием (3D-FASTR), чтобы обеспечить объемное изображение клеток вокруг отслеживаемой вирусной частицы. 3D-FASTR основана на двухфотонный лазерной сканирующей микроскопии. Микроскоп должен быть оснащен электрически настраиваемой линзой, которая выполняет дистанционную фокусировку лазера во время непрерывного вертикального фокального сканирования в диапазоне 8 мкм. Трехмерное изображение формируется без перемещения столика с образцом и идеально дополняет 3D-SMART.

Используя 3D-TrIm, ученые проанализировали путешествие лентивирусных частиц, псевдотипированных G-белоком вируса везикулярного стоматита (VSV-G) и несущих флуоресцентные белки, в монослоях клеток HeLa или GM701. Различные структуры клеток помечались флуоресцентными красителями.

Ученые исследовали траектории коротких временных контактов (скимминга) вирусоподобных частиц с клеточной поверхностью, а также наблюдали отдельные случаи более длительных контактов. Они, в отличие от скимминга, сопровождались резкими изменениями способности частиц к диффузии в матриксе. Вирус сначала претерпевает несколько скимминговых событий, а примерно через 70 секунд, когда расстояние между вирусом и клеткой достигает минимума, диффузионная способность частицы падает на два порядка и она остается связанной с поверхностью. Также ученые заметили, что связанные вирусные частицы могут отделяться от поверхности клеток, продвигаться в матриксе дальше или даже снова адсорбироваться в другом месте.

Метод 3D-TrIm позволяет отслеживать наноразмерные структуры на поверхности клетки. Так, ученые проанализировали взаимодействие между VLP и цилиндрическими выступами на клеточной мембране. Несмотря на то, что выступ не окрашен и, следовательно, не должен быть виден на изображении, путь вируса вдоль его поверхности создает карту с высоким разрешением, как бы вырезая наноразмерную цилиндрическую морфологию поверхности выступа в пространстве.

Авторы работы также продемонстрировали большой потенциал 3D-TrIm для анализа сложных многослойных клеточных моделей, которые лучше воспроизводят условия in vivo. Например, изучать внеклеточную динамику вирусов (в том числе респираторных) можно на системе, включающей эпителий, защищенный толстым слоем слизи и перицилиарным слоем. Авторы создали такую систему, вырастив клетки эпителия толстой кишки на полупроницаемой мембранной подложке. Подложку перевернули таким образом, чтобы клетки висели над поверхностью покровного стекла. В эксперименте с псевдовирусом ученые обнаружили значительные, не описанные ранее изменения в динамике вириона, когда он взаимодействует с клеточной поверхностью в этой системе.

Авторы отмечают, что 3D-TrIm полностью совместим с активными биологическими процессами, что позволяет изучать и другие стадии жизненного цикла вируса, происходящие внутри живой клетки. Важно отметить, что этот метод может найти применение в любой системе, где происходит быстрая динамика наноразмерных объектов, включая, например, доставку наноразмерных лекарств-кандидатов в легкие и через сосудистую сеть опухоли.