Биопсия цитоплазмы позволит изучить транскриптом, не убивая клетку

Ответы единичных клеток в составе ткани на внутренние или внешние стимулы различаются. Скорость реакции, сопровождающейся изменением фенотипа, зависит от молекулярного состояния клетки. Однако проанализировать одновременно молекулярный и фенотипический ответы довольно сложно, так как большинство методов генетического профилирования требуют разрушения клетки. На данный момент существует несколько подходов к исследованию транскриптома одной и той же живой клетки в разных временных точках. Среди них есть полностью компьютерные, моделирующие динамику сплайсинга мРНК, и основанные на мечении РНК, чтобы по меткам отличать старые молекулы от новых. Но такие методы применимы только для анализа в течение коротких отрезков времени и могут охватить лишь небольшое число признаков. Кроме того, начальное состояние клетки определяется статистически. Это подтолкнуло швейцарских ученых на создание Live-seq — метода транскриптомного анализа, при котором РНК забирается из живой клетки с помощью биопсии цитоплазмы. В основе метода лежит технологии FluidFM (Fluidic Force Microscopy, жидкостная атомно-силовая микроскопия).

В предыдущих исследованиях команда показала, что с помощью FluidFM можно отбирать цитоплазму, сохраняя жизнеспособность клетки. Наличие в биоптатах мРНК определенных генов подтвердили с помощью количественной ПЦР. (Устройство и принцип работы первого варианта системы подробно описаны в статье по ссылке.) В новой работе команда оптимизировала процедуру экстракции цитоплазмы для получения максимального количества РНК. Объем пробы составляет всего пять пиколитров. Чтобы свести к минимуму деградацию РНК и предотвратить потерю образца при переносе в пробирку, ученые сократили время и снизили температуру экстракции. Зонд FluidFM предварительно загрузили буфером с ингибиторами РНКаз, а экстракт высвобождался в микролитровую каплю буфера для РНК-секвенирования.

Также ученым предстояло оптимизировать синтез кДНК с ультрамалого количества выделенной РНК. Они выбрали Smart-seq2 (Illumina) как один из наиболее чувствительных методов РНК-секвенирования и оптимизировали протокол так, чтобы можно было с высокой надежностью работать с РНК в количестве 1 пг.

Затем ученые протестировали оптимизированные FluidFM и Smart-seq2 на клетках разных типов. Они выявили около 2 100 генов в иммортализованных бурых преадипоцитах мыши. Глубина секвенирования составила около 1 млн. прочтений на образец. Далее ученые провели ряд экспериментов на бурых преадипоцитах мыши, первичных жировых стволовых и прогениторных клетки мыши и моноцитарных клеточных линиях. Они показали, что прочтения покрывают полные транскрипты, а данные, полученные с помощью Live-seq, кластеризуются в зависимости от типа и состояния клеток. Результаты Live-seq по качеству и объему были сопоставимы с результатами обычного секвенирования РНК единичных клеток.

В дополнительных экспериментах ученые проверили жизнеспособность трех типов клеток после цитоплазматической биопсии. Она составила 85–89%. Клетки быстро восстанавливались, их цикл и динамика роста сохранялись.

По мнению авторов, технология Live-seq преобразит транскриптомику единичных клеток, а в перспективе и другие single-cell-омики.

Оптимизацию анализа единичных клеток ведет множество команд. Так, международная группа ученых разработала систему для секвенирования РНК-единичных клеток в небольших образцах.