CAR-T клетки стали эффективнее с мутациями, найденными в лимфоме

CAR-T терапия хорошо зарекомендовала себя при лечении раков крови. Однако при переносе этого подхода на солидные опухоли его эффективность значительно уменьшается ввиду низкой персистенции CAR-T клеток в опухолях, иммуносупрессивного действия микроокружения и истощения T-клеток. В то же время клональные T-клетки, задействованные в аутовоспалительных процессах, и злокачественные T-клетки приспосабливаются к иммуносупрессивной среде благодаря приобретению и отбору специфических мутаций. Авторы нового исследования, опубликованного в Nature, идентифицировали мутации, которые лежат в основе фенотипа клональных T-клеток, и показали, что введение таких мутаций в CAR-T клетки повышает эффективность терапии.

Сначала ученые проанализировали потенциальные драйверные мутации клональных T-клеточных неоплазий. Таким образом они обнаружили 71 мутацию, из которых 61 является точечной (приводящей к несинонимичным заменам или к приобретению функции с укорачиванием белка). Мутации входили в состав 40 разных генов.

Мутантные формы этих генов, а также результаты слияния генов, вставили в баркодированные лентивирусные векторы и получили библиотеку из 116 уникальных конструктов. Чтобы оценить эффект этих мутаций на фенотип T-клеток, ученые использовали репортерную линию Jurkat, позволяющую отследить активацию сигнальных путей NFAT, NF-κB и AP-1. Далее клетки были трансдуцированы CD19-CD28z-CAR или CD19-BBz-CAR, а также конструктами из библиотеки. Через 24 часа после кокультивации этих клеток с клетками-мишенями, экспрессирующими или не экспрессирующими CD19, ученые определили активность сигнальных путей NFAT, NF-κB и AP-1 в производных Jurkat. Кроме того, с помощью иммуноферментного анализа они оценили секрецию IL-2, а для клеток с CD19-BBz-CAR оценили уровень истощения (экспрессию PD-1).

В конечном итоге были выделены 24 мутации, приводящие к существенным различиям между мутантными и контрольными клетками на уровне сигнальных путей. Эти мутации также сказываются на секреции IL-2. Например, при наличии мутаций в гене BRAF уровень секреции IL-2 увеличивается в 15–396 раз, а в гене CARD11 — в 359 раз. Стоит отметить, что для проявления некоторых мутаций была необходима стимуляция клеток антигеном. Таким образом, мутации могут существенно влиять на фенотип CAR-T клеток.

Чтобы проверить эффект мутаций in vivo, исследователи воспользовались мышами с ксенографтами и провели систематический поиск мутаций, повышающих эффективность CAR-T клеток, при помощи T-клеток человека, экспрессирующих CAR против CD19 и трансдуцированных лентивирусными конструктами из библиотеки. Авторы показали, что в опухолях чаще всего встречались клетки, которые несут замену в белке MYCN (p.P44L), слияние генов CARD11 и PIK3R3, замены в CCND3 (p.P284S), STAT3 (p.G618R) и RLTPR (p.Q575E).

Слияние CARD11–PIK3R3 повышало NF-κB и AP-1 сигналинг, а также выработку IL-2, но не NFAT или PD1. Благодаря этому авторы отобрали слияние CARD11–PIK3R3 для дальнейшего тестирования. Изначально его выявили у пациента с T-клеточной лимфомой.

Наличия одного только CARD11–PIK3R3 было недостаточно, чтобы вызвать пролиферацию, не зависящую от присутствия антигена. CARD11–PIK3R3 индуцировало более высокий уровень экспрессии IL-2, IFNγ, TNF и IL-5 в CD8+ BBz-CAR T-клетках. Секреция цитокинов зависела от присутствия антигена. Несущие CARD11–PIK3R3 CAR-T клетки уничтожали рак (рак крови и солидные опухоли) лучше, чем контрольные CAR-T клетки, они также хорошо переносились. У трех мышей из пяти (60%) несущие CARD11–PIK3R3 CAR-T клетки полностью уничтожили солидные опухоли через три месяца, тогда как контрольные мыши до того момента не доживали. При сравнении терапевтического потенциала меньших доз T-клеток (20 000 вместо 2 000 000) анализ показал, что 20 000 клеток было достаточно.

Эксперименты подтвердили, что результат слияния CARD11–PIK3R3 повышает активность CAR-T клеток, усиливая передачу сигнала через T-клеточный рецептор. Таким образом, введение в CAR-T клетки мутаций, встречающихся в T-клеточных опухолях, повышает их противораковую активность, при этом сами клетки не становятся раковыми.

В редких случаях терапия CAR-T клетками может способствовать развитию T-клеточной лимфомы