CasX — маленькая нуклеаза с большим будущим?

Геномное редактирование с использованием нуклеаз Cas уже называют «открытием века». Ни одна технология, разработанная до открытия CRISPR/Cas, не позволяет так эффективно редактировать геном. Тем не менее, несмотря на скандальную работу китайского исследователя, до реального применения технологии редактирования генома в медицине пока далеко. Нуклеазы Cas допускают немало ошибок при редактировании, причём не все из них происходят в сайте разрезания. Мало того, размер классической Cas9 слишком велик для существующих вирусных систем генной терапии.

Поэтому исследователи находятся в постоянном поиске новых ферментов семейства Cas в надежде найти среди них «недостающее звено» для успешного применения в медицине. Молекулярные биологи иногда называют такие поиски немного насмешливо — «зоология». Но при работе с новыми семействами белков без этого не обойтись.

Ферменты семейства CasX были классифицированы двумя годами ранее при изучении баз данных последовательностей бактериальных ДНК методами сравнительной геномики. А в лаборатории Дженнифер Дудны, одной из первооткрывательниц технологии CRISPR/Cas, обратили внимание на необычную для нуклеаз этого типа структуру CasX. Компьютерный анализ показал, что эта нуклеаза эволюционировала другим путём, чем ранее описанные Cas, и имеет в качестве предка транспозазу. Классический образчик конвергентной эволюции решили изучить детально. Функциональный анализ показал, что фермент ведёт себя во многом, как классическая Cas9: использует crРНК и tracrРНК. Обнаружен и PAM-мотив. При этом CasX существенно меньше Cas9 (длина полипептидной цепи менее 980 аминокислотных остатков), и механизм разрезания ДНК отличается от того, что использует Cas9: фермент атакует цепи ДНК последовательно, используя один активный центр. Исследование комплекса CasX методом криоэлектронной микроскопии выявило ещё один интересный факт: белковая часть CasX конформационно весьма лабильна и стабилизируется только при связывании с молекулами РНК, которые выполняют в этом ферменте роль «позвоночника». Вращаясь вокруг него, CasX расщепляет сначала одну цепь ДНК, а потом и другую. Искусственное слияние двух природных РНК, работающих с CasX в РНК-гид, которое давно используется для Cas9, картину взаимодействия не изменяет.

А что же насчёт редактирования ДНК? С этим тоже всё обстоит так же, как и у Cas9: активная нуклеаза способна редактировать геномы эукариот, а инактивированная – блокировать транскрипцию гена, на который она нацелена. Так что, как любят говорить энзимологи, CasX является bona fide CRISPR-нуклеазой. То есть обладает всеми её свойствами.

А в чём преимущества? Во-первых, небольшой размер CasX, которую переквалифицировали в Cas12e, позволяет поместить в вектор для генной терапии не только саму нуклеазу, но и различные управляющие элементы, которые могут намного повысить эффективность процедуры. Во-вторых, неспецифическая активность, в основном против одноцепочечной ДНК, которую часто называют «транс-активность», у CasX низкая. И наконец, нуклеаза происходит из бактерий, никогда с человеком не пересекающимися, а значит, вероятность иммунного ответа к этой нуклеазе невысока.

Специфичность CasX пока глубоко не изучена. Будем надеяться, что мы скоро узнаем о том, есть или нет у CasX ещё одно преимущество по сравнению со «старыми» нуклеазами. В любом случае, описанная работа показывает, что «зоологический» подход к изучению Сas-нуклеаз ещё долго будет иметь право на жизнь.