Часть генов вирулентности токсоплазмы зависит от IFN-γ

Токсоплазма (Toxoplasma) — паразитический протист, вызывающий потенциально летальные инфекции человека и животных. К настоящему времени описана большая часть генетических факторов вирулентности токсоплазмы, однако картина все еще остается не полной. В новой работе ученые из Японии представили новый метод in vivo CRISPR скрининга и описали ряд новых генов, влияющих на вирулентность токсоплазмы, действие части которых зависит от присутствия интерферона гамма (IFN-γ).

Для CRISPR скрининга авторы разработали библиотеку из 3767 гидовых РНК (гРНК), нацеленных на 376 генов. Эти гены кодируют (или предположительно кодируют) белки, секретируемые роптриями — специальными органеллами токсоплазмы (ROP белки) — или плотными гранулами — другим типом органелл (GRA белки). Первичная проверка библиотек была проведена in vitro на культурах клеток линии Vero. Полученные in vitro результаты соотносились с ранее опубликованными данными о связи тех или иных генов токсоплазмы с ее вирулентностью.

Для in vivo модели были использованы мыши линии C57BL/6. При введении паразитов в брюшную полость животные погибали через три дня, что не позволяло получить качественных результатов. Тогда ученые решили провести инъекцию токсоплазмы в подушечки лап мышей. При такой локализованной инфекции животные прожили более 7 дней. На седьмой день после инъекции исследователи отбирали образцы селезенки для дальнейшего анализа. Полученную из них суспензию клеток инокулировали в культуру линии Vero для размножения и дальнейшего анализа паразитов. Авторы провели три независимых итерации in vivo тестов, результаты которых показали сильную корреляцию — полученный уровень воспроизводимости говорит о надежности метода.

При сравнении результатов in vivo анализа с ранее опубликованными данными стало ясно, что он выявил как ранее описанные гены, влияющие на вирулентность, так и ряд новых потенциальных генов. Для подтверждения функции генов-кандидатов ученые получили варианты токсоплазмы, нокаутные по этим генам, и инфицировали ими мышей. Снижение вирулентности паразитов с нокаутом генов GRA72, GRA23, RON1, MIC19 и GRA50 подтвердило их значение в развитии инфекции.

Ранее было описано, что влияние некоторых генов токсоплазмы на вирулентность зависит от присутствия IFN-γ. Так, предыдущие исследования показывают, что ROP5 и ROP18 намного более вирулентны в мышах, дефицитных по IFN-γ, чем в диком типе. Для изучения этого аспекта исследователи повторили in vivo скрининг на Ifngr1^-/- мышах. Зависимость подтвердилась, а также были обнаружены еще несколько генов, влияние которых на вирулентность токсоплазмы было IFN-γ-зависимым. Кроме ранее описанных, гены RON11, RON1 и GRA23 показали значимые различия в эффекте нокаута в мышах дикого типа и Ifngr1^-/-.

Далее ученые сгенерировали еще одну библиотеку гРНК, на этот раз нацеленных на гены, связанные с ядром и эндомембранной системой. Влияние на вирулентность было показано для генов EPT1, RAB4, ALG2, DGAT1, GST2 и TGT1_203160, где два последних также зависят от IFN-γ.

С помощью еще одной библиотеки гРНК, нацеленых на гены метаболизма, авторы идентифицировали новые зависимые от IFN-γ гены, влияющие на вирулентность — TGGT1_215890, USPase, Rad23, HID1, и Sui1.

В первых in vivo тестах GRA72 показал значительно большее влияние на вирулентность по сравнению с другими идентифицированными генами, поэтому ученые решили более подробно изучить механизм его действия. Фенотип GRA72^- паразитов был очень схож с GRA17^-, указывая на их возможную связь. Уровень экспрессии GRA17 у GRA72^- паразитов оставался на уровне дикого типа, однако распределение белка в клетке оказалось нарушено — вместо локализации на паразитофорной вакуоли GRA17 формировал агрегаты в других частях клетки. Восстановление экспрессии GRA72 возвращало нормальное распределение GRA17. Также было показано схожее влияние GRA72 на распределение GRA23 — паралога GRA17.

Авторы заметили, что гены метаболизма и эндомембранной системы, ответственные за вирулентность токсоплазмы, включают в себя гены, задействованные в сигнальном пути UFM1. В зарубежной литературе он известен как UFMylation. Исследователи показали, что нарушение работы этого сигнального пути приводит к снижению вирулентности токсоплазмы в мышах дикого типа, но не в Ifngr1^-/- мышах.

Таким образом, авторы не только расширили существующие представления о генетике вирулентности токсоплазмы, но и представили новый метод in vivo CRISPR скрининга.

Токсоплазма расселяется по организму внутри макрофагов