CRISPR оптимизировали для множественной активации генов в растениях

CRISPR удается применять не только для создания нокаутов, но и для активации генов как в клетках животных, так и у растений. Для этого используют деактивированный белок Cas9 (dCas9), неспособный к разрезанию ДНК, который с помощью гидовой РНК распознает определенную последовательность рядом с геном-мишенью. Факторы, активирующие транскрипцию, могут быть слиты с dCas9, или распознавать специфические аффинные метки, прикрепленные к dCas9, или, наконец, взаимодействовать с аптамерами в составе гидовой РНК.

Исследователи из Мэрилендского университета и Калифорнийского университета в Беркли улучшили свою систему активации генов в растениях — CRISPR-Act2.0. Для предыдущей системы они в дополнение к dCas9, слитой с активатором транскрипции VP6,4 разработали гидовые РНК, содержащие две аптамерные последовательности к белку MCP, посредством которого привлекались дополнительные молекулы VP64.

Теперь авторы создали систему активации следующего поколения — CRISPR-Act3.0, в которой каждая из аптамерных последовательностей привлекает множество молекул фактора VP64.

Для этого адаптировали разработанную ранее систему SunTag — белковую молекулу с повторяющимися эпитопами, которые распознаются антителами. Если система используется дли визуализации, эти антитела могут нести флуоресцентный белок. SunTag, рекрутирующий с помощью антител активаторы транскрипции, можно прикрепить к dCas9 и использовать для направленной экспрессии генов.

В новом исследовании авторы объединили оба подхода: аптамеры в гидовой РНК и SunTag. Они присоединили молекулу SunTag, в которой многократно повторенные эпитопы GCN4 через антитела scFv привлекали множество копий активирующего белка VP64, не к dCas9, а к белку MCP. Таким образом, участок ДНК распознается одной гидовой РНК, на каждый из двух аптамеров привлекаются две копии химерной белковой конструкции 2xMCP-10xGCN4, на каждую из которых, в свою очередь, привлекаются до 10 копий VP64 (см . рисунок).

Новый метод позволил повысить экспрессию гена OsER1 в протопластах риса в 250 раз, в то время как все имевшиеся ранее способы, включая предыдущую модификацию dCas9-SunTag, не повышали активность более чем в 40 раз.

Авторы также проверили возможность активации нескольких генов одновременно с помощью CRISPR-Act3.0. При активации семи генов риса удалось достичь не менее чем 20-кратного повышения экспрессии каждого из них. У Arabidopsis thaliana, распространенного модельного растения, были активированы одновременно гены AtFT и AtTCL, отвечающие соответственно за цветение и развитие трихом (волосков). При активации этих генов в 130-240 раз и 3-8 раз наблюдалось как ранее цветение, так и изменение фенотипа трихом.

Выбор гидовых РНК для систем с Cas9 ограничен определенными требованиями к распознаваемой последовательности: рядом с ней должна находиться короткая последовательность, смежная с протоспейсером (PAM). Авторы предприняли попытку расширить возможности метода, применяя другие Cas системы, однако они не были эффективнее Cas9.

Интересно, что гидовые РНК к последовательности некодирующей цепи ДНК чаще оказывались эффективными. Авторы отмечают, что хотели бы изучить этот феномен подробнее.

CRISPR-Act3.0 может быть полезен в улучшении свойств сельскохозяйственных растений, например, на стадии фундаментального поиска генов, ответственных за определенные свойства.