Десенситизация CXCR4 необходима для поддержания баланса между продукцией миелоидных и лимфоидных клеток

Синдром WHIM — это врожденный иммунодефицит, вызванный мутациями в рецепторе хемокинов CXCR4. Из-за мутаций рецептор укорачивается и теряет способность к десенситизации, которая в норме происходит при длительном воздействии хемокина. Французские исследователи показали, что этот дефект нарушает дифференцировку гемопоэтических плюрипотентных клеток-предшественников в клетки лимфоидного происхождения, смещая чашу весов в сторону миелопоэза, на фоне чего и развивается иммунодефицит.

Credit:
123rf.com

Гемопоэтические мультипотентные клетки-предшественники (MPP) — это клетки, которые находятся в костном мозге и дают начало клеткам крови лимфоидного и миелоидного ряда. Выделяют несколько подтипов MPP: например, клетки MPP3 больше склонны к дифференцировке в гранулоциты и макрофаги, а MPP4 — в лимфоидные клетки. Разные популяции MPP находятся в нишах костного мозга, где задерживаются из-за действия CXCL12 — хемокина, который вырабатывается периваскулярными стромальными клетками костного мозга. На него реагирует рецептор CXCR4. При длительном воздействии хемокина происходит десенситизация рецептора: он становится нечувствительным к нему и интернализуется, в результате чего MPP могут покинуть свою нишу в костном мозге, получить внешние сигналы и дифференцироваться в другие клетки крови.

Синдром WHIM (от warts, hypogammaglobulinemia, immunodeficiency and myelokathexis — бородавки, гипогаммаглобулинемия, иммунодефицит и миелокатексис) — это врожденный иммунодефицит, который характеризуется сниженным уровнем лимфоцитов и нейтрофилов, причем последние просто не выходят из костного мозга. Это заболевание вызывается мутациями в CXCR4, которые приводят к укорачиванию его C-конца. Из-за этого рецептор теряет способность к десенситизации и все время остается в активированном состоянии. Французские ученые решили узнать, как отсутствие десенситизации CXCR4 приводит к нарушению баланса между миело- и лимфопоэзом.

Исследование проводили на трансгенных мышах, несущих ген Cxcr4 с распространенной среди пациентов с синдромом WHIM мутацией в 1013 нуклеотиде. Рецептор с такой нонсенс-мутацией укорочен на 15 аминокислот на C-конце, в результате чего он теряет способность к десенситизации и последующей интернализации.

Для начала с помощью проточной цитометрии ученые проанализировали состав популяции клеток MPP в костном мозге мышей. У мышей с мутацией в Cxcr4 снижалась доля MPP4, но при этом повышалась доля MPP2 и MPP3 — то есть в костном мозге таких мышей баланс смещался в сторону клеток миелоидного, а не лимфоидного ряда. Также ученые подтвердили, что сами MPP не экспрессировали Cxcl12, но могли реагировать на стимуляцию этим хемокином: у клеток с мутированным Cxcr4 повышался хемотаксис, но, как и ожидалось, не наблюдалось интернализации рецептора. 

Разные субпопуляции MPP получаются при дифференцировке короткоживущих гемопоэтических стволовых клеток (MPP1), причем обычно доля MPP4 превышает долю MPP2 и MPP3. Исследователи предположили, что обратная картина при синдроме WHIM может быть связана с нарушением дифференцировки MPP1. Они выделили эти клетки из костного мозга здоровых и трансгенных мышей, а потом сравнили их способность к дифференцировке in vitro. Оказалось, что здоровые и мутантные MPP1 одинаково эффективно дифференцируются в MPP2 и MPP3, но при этом мутантные MPP1 хуже образуют MPP4. Восстановление этой способности при использовании антагониста Cxcr4 — AMD3100 — подтвердило, что нарушение вызвано чрезмерной активацией рецептора. Анализ степени открытости хроматина с помощью ATAC-seq показал, что в мутантных MPP1 снижена доступность участков, важных для дифференцировки в лимфоидные клетки, а участки, нужные для формирования миелоидных клеток, наоборот, более доступны.

На следующем этапе ученые проверили, связаны ли наблюдаемые изменения с внутренними дефектами MPP или же с неспособностью воспринимать внешние сигналы. Для этого они провели эксперименты по восполнению клеточной популяции костного мозга мышей, получивших летальную дозу облучения. После облучения им подсаживали клетки костного мозга здоровых или трансгенных мышей. После подсадки клеток от трансгенных доноров спустя 3 или 16 недель в костном мозге животных также была снижена доля MPP4, в то время как представленность MPP2 и MPP3 была в норме. Исследователи заключили, что неспособность к дифференцировке в MPP4 связана с внутренними дефектами в клетках.

Вместе с тем ученые не могли просто отвергнуть гипотезу о том, что постоянная активация Cxcr4 способна задерживать клетки в костном мозге. Используя иммунофлуоресцентное окрашивание и гибридизацию in situ, они охарактеризовали расположение клеток в костном мозге мышей. Оказалось, что мутантные MPP4 находятся на большем расстоянии от артериол, чем клетки дикого типа. Возможно, из-за этого они могут просто не получать сигналы к дифференцировке от периваскулярной ниши.

Транскриптомный анализ показал, что в мутантных MPP4 снижена экспрессия генов, которые нужны для дифференцировки в лимфоидные клетки (например, Ikzf1, Flt3, Dntt), а гены, связанные с окислительным фосфорилированием, чрезмерно активированы. Клетки MPP и в норме полагаются на окислительное фосфорилирование: они переходят на него с анаэробного гликолиза, который используют их предшественники — гемопоэтические стволовые клетки. Вместе с тем в мутантных MPP4 вследствие повышенной метаболической активности (например, они усиленно потребляли кислород) повышался сигналинг нижележащих путей, в том числе пути Akt-mTOR. В таких клетках генерировалось больше активных форм кислорода из-за интенсивной работы митохондрий, вместе с тем снижалось потребление глюкозы.

Ученые обнаружили, что в мутантных MPP4 повышается число поврежденных митохондрий. Это определили, окрасив митохондрии тетраметилродаминэтиловым эфиром: он накапливается только в активных митохондриях, но не поврежденных, потому что в последних нарушается мембранный потенциал. Эксперименты, в которых MPP4 стимулировали Cxcl12 в присутствии или отсутствии AMD3100, показали, что метаболическая активность MPP4 регулируется через ось Cxcl12-Cxcr4. При этом нарушение баланса в пользу миелопоэза вызывалось дисфункцией митохондрий, так как число зрелых миелоидных клеток снижалось при обработке MPP4 антиоксидантами (митохинол) или разобщающим агентом (карбонилцианид м-хлорофенилгидразон).

Восстановить баланс между миелопоэзом и лимфопоэзом ученым удалось за счет воздействия на ось Cxcl12-Cxcr4. Если мутантные MPP4, в которых было много поврежденных митохондрий, обрабатывали AMD3100, то сигналинг через Cxcr4 снижался, и уже через 4 и 7 дней MPP4 (как мутантные, так и дикого типа) образовывали меньше миелоидных клеток. При введении этого вещества мышам у них снижалось число MPP4 в костном мозге. Вместе с тем при длительном применении AMD3100 у трансгенных мышей нормализовалось число зрелых B-клеток, а также разрешалась лимфопения.

В мутантных MPP4 накапливалось больше фосфорилированного mTOR, поэтому ученые также оценили воздействие на связанный с ним сигнальный путь. Для этого использовали рапамицин — ингибитор mTOR. In vitro это также снижало количество зрелых миелоидных клеток, при этом MPP4 смогли дифференцироваться в B-клетки. Однако in vivo хронический прием рапамицина не восстанавливал баланс между популяциями MPP, хотя в MPP4 трансгенных мышей на фоне лечения восстанавливалась митохондриальная активность.

Исследователи заключают, что Cxcr4, по-видимому, регулирует дифференцировку MPP4 как внутренне — через путь mTOR, — так и внешне — через поступающие из ниши сигналы. В частности, именно поэтому рапамицин может только частично «вылечить» отклонения, которые приводят к развитию синдрома WHIM.


Иммунные клетки наследуют искусственно созданное гиперметилирование и становятся «агрессивней»

Источник

Rondeau, V. et al. CXCR4 signaling determines the fate of hematopoietic multipotent progenitors by stimulating mTOR activity and mitochondrial metabolism. // Science Signaling (2024). DOI: scisignal.adl5100

Добавить в избранное