Для нового коронавирусного теста на основе CRISPR-Cas13a не нужно оборудование

Ученые из Института Эли и Эдит Бродов с коллабораторами ранее разработали тест на коронавирус SHINEv.1 (подробнее об этом — на PCR.NEWS). Он объединяет принцип таргетной детекции нуклеиновых кислот SHERLOCK и процесс инактивации нуклеаз HUDSON и не требует предварительного выделения РНК. Однако в SHINEv.1 есть несколько шагов с нагреванием, а также реагенты необходимо хранить на холоде. Та же группа ученых упростила технологию и опубликовала результаты по тесту на коронавирус SHINEv.2 (streamlined highlighting of infections to navigate epidemics, version 2) в журнале Nature Biomedical Engineering. По мнению авторов, этот тест можно будет применять повсюду, в том числе на дому.

В SHINEv.1 использовалась ORF1a коронавируса, однако авторы предположили, что метод можно улучшить, выбрав таргетные сайты с более активными праймерами и CRISPR РНК (crRNA). Они использовали инструмент ADAPT и 308 315 геномов SARS-CoV-2, чтобы подобрать праймеры и crRNA, которые таргетируют высоко консервативные последовательности S-гена. Такой тест в 1–2 раза быстрее и в 10 раз чувствительнее, чем тот, который использует ORF1a.

Для того, чтобы увеличить доступность SHINEv.2, его оптимизировали для использования лиофилизированных реагентов и процессирования образца без нагрева. HUDSON требует инкубации при двух температурах. Поэтому в новой версии теста исследователи использовали FastAmp от Intact Genomics. Эти реагенты для лизиса совместно с 5% ингибиторами РНКаз снижали активность РНКаз в образце на 85% и инактивировали коронавирус. Новый способ инактивации также совместим с методом SHINE.

Лиофилизация буфера, изначально используемого для SHINE, приводила к потере активности реагентов. Поэтому авторы оптимизировали его состав, добавив сахарозу и маннитол и убрав PEG и KCl. С таким буфером лиофилизированные реагенты для SHINE сохраняли активность больше недели при комнатной температуре и пять месяцев при хранении на холоде.

Метод SHINEv.2 требует меньше вмешательства от пользователя — пять шагов и десять минут — по сравнению с SHINEv.1, который требует 20 шагов и 45 минут. Авторы показали на синтетических РНК-стандартах, что SHINEv.2 позволяет детектировать 100 копий РНК в 1 микролитре пробы. Такого же результата добились после транспортировки с системы на другой континент, в Нигерию.

После этого исследователи применили новый метод к 72 клиническим образцам из носоглотки. SHINEv.2 детектировал РНК SARS-CoV-2 в 38 из 42 ПЦР-положительных образцов (чувствительность 90,5%) и не детектировал коронавирус ни в одном ПЦР-отрицательном образце (специфичность 100%). SHINEv.2 был в 50 раз более чувствительным, чем антигенные тесты, хотя и занимал больше времени. Более того, новая технология легко адаптируется, что и продемонстрировали авторы на нескольких вариантах, вызывающих опасения, включая дельту и омикрон.

Авторы оптимизировали систему для использования вне лаборатории. Так, они добавили внутренний контроль и упростили детекцию результатов. Однако SHINEv.2 требует инкубации при 37 °C в течение 90 минут. Авторы проверили, нельзя ли использовать температуру тела. Действительно, реакция успешно прошла после инкубации смеси под мышкой. При комнатной температуре чувствительность значительно падает. Исследователи предпринимают шаги для устранения этой проблемы.