Тест на коронавирус на основе CRISPR-Cas13a без выделения РНК

Ученые из Института Эли и Эдит Бродов с коллабораторами разработали новый тест на коронавирус на основе платформы SHERLOCK. Препринт с описанием теста размещен на bioRxiv. Метод, объединяющий принцип таргетной детекции нуклеиновых кислот SHERLOCK и процесс инактивации нуклеаз HUDSON, получил название SHINE (SHERLOCK and HUDSON Integration to Navigate Epidemics) и позволяет определять РНК коронавируса в образце без предварительной экстракции.

Для начала ученые оптимизировали методы SHERLOCK и HUDSON так, чтобы можно было использовать их совместно для обнаружения РНК SARS-CoV-2. (Специалисты Института Эли и Эдит Бродов ранее совмещали SHERLOCK и HUDSON для детекции вируса денге в крови и слюне.) В основе технологии SHERLOCK лежит амплификация нуклеиновых кислот с последующим распознаванием мишеней с помощью CRISPR-Cas-нуклеаз. При расщеплении мишени нуклеазой возникает флуоресцентный сигнал. В данной работе в качестве таргетной последовательности была выбрана открытая рамка считывания 1a (ORF1a) SARS-CoV-2, а в качестве рабочей нуклеазы — Cas13a, направляемая специфичной к мишени crRNA. Методика SHERLOCK, как правило, включает экстракцию РНК из образца и детекцию мишени в два этапа: сначала изотермическая рекомбиназная полимеразная амплификация с обратной транскрипцией, затем обработка пробы РНК-полимеразой и Cas-нуклеазой. Авторы препринта подобрали реагенты так, что амплификацию и распознавание мишени стало возможно проводить в одной пробирке в один шаг, занимающий от 30 минут до 1 часа.

Затем ученые заменили экстракцию РНК на HUDSON — инкубирование образца в специальной реакционной смеси при повышенной температуре. Это приводило к инактивации как самого вируса, так и РНКаз, предотвращая разрушение вирусной РНК ферментами. Продолжительность этого шага сократили до 10 минут.

Результат анализа можно фиксировать как на тест-полосках, так и с помощью специально разработанного мобильного приложения, определяющего флуоресценцию прямо в пробирке с реакционной смесью. (Авторы отмечают, что для использования тест-полосок пробирку необходимо открыть, а это повышает вероятность контаминации пробы.)

Для первичной проверки метода использовали синтетическую РНК. SHINE обнаруживал 10 копий РНК в 1 микролитре пробы, если использовался флуоресцентный сигнал, и 50 копий/мкл при использовании тест-полосок. Затем метод опробовали на клинических образцах — мазках из носоглотки от 30 пациентов с COVID-19, подтвержденным ПЦР-тестом, и 20 пациентов с отрицательным результатом ПЦР-теста.

SHINE с детекцией флуоресцентного сигнала с помощью мобильного приложения применили ко всем 50 образцам. РНК коронавируса была выявлена в 27 из 30 положительных образцов, что соответствует чувствительности 90%, и не обнаружена ни в одном из 20 отрицательных образцов (специфичность 100%). SHINE с визуализацией результата на тест-полосках применили к 6 положительным образцам — во всех случаях результат был положительный. Инактивация HUDSON длилась 10 минут, этап SHERLOCK занял 40 минут, то есть анализа образца длился 50 минут.

Таким образом, SHINE показал себя как простой и быстрый метод определения РНК SARS-CoV-2 в образце без экстракции, для применения которого требуется лишь нагревательный элемент на этапе инактивации. Это уже не первый тест на платформе SHERLOCK, разработанный для диагностики COVID-19. Так, в середине мая вышел препринт с описанием системы STOPCovid, а набор Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 получил разрешение FDA на экстренное использование.