ДНК-копии участков генома коронавируса встраиваются в геном человека

Продолжительное выделение РНК SARS-CoV-2 и повторные положительные результаты ПЦР зарегистрированы у многих пациентов, которые чаще всего не заразны. Исследователи из Массачусетского технологического института проверили, может ли РНК коронавируса SARS-CoV-2 подвергаться обратной транскрипции. Если получившаяся кДНК будет интегрирована в геном хозяина, она сможет, в свою очередь, транскрибироваться и создавать РНК-копии генома, которые и выявляются при «поздних» положительных тестах.

Некоторые количества фермента обратной транскриптазы (ОТ), которая синтезирует ДНК на матрице РНК, в человеческих клетках присутствуют всегда. Например, ОТ производят ретротранспозоны LINE-1 — мобильные элементы, которые составляют около 17% генома человека (но активны обычно только около ста копий из полумиллиона). Их обратная транскриптаза способствует их собственному перемещению, а также перемещению других неавтономных мобильных элементов, таких как Alu.

Руководитель работы результаты которой опубликованы в виде препринта на bioRxiv — Рудольф Йениш, профессор биологии MIT и один из основателей Института биомедицинских исследований Уайтхеда, пионер в создании трансгенных животных. Он и Беатрис Минц получили первое трансгенное млекопитающее — мышь, в геном которой была встроена последовательность ДНК с помощью онкогенного ретровируса — еще в 1974 году, до того, как сам термин «трансгенный» стал общеупотребительным.

Сначала ученые проанализировали опубликованные наборы данных по РНК-секвенированию культивированных клеток, инфицированных SARS-CoV-2, и клеток пациентов. В этих наборах данных они обнаружили значительное количество химерных транскриптов, включающих участки как вирусной, так и клеточной последовательности. Такие транскрипты могли возникнуть при интеграции вирусных последовательностей в хозяйский геном. Чем больше было вирусной РНК в образце, тем больше в нем обнаруживалось химерных прочтений: в целом 0,004–0,14% от всех ридов SARS-CoV-2. Больше всего их было в клетках из жидкости бронхоальвеолярного лаважа, полученных от пациентов с тяжелой формой COVID-19, а меньше всего — в клетках лейкоцитарной пленки (фракция лейкоцитов и тромбоцитов при центрифугировании крови), в которых и вирус практически не обнаруживался.

Большая часть химерных РНК включала последовательности гена белка нуклеокапсида N: РНК этого белка — одна из самых обильных субгеномных РНК коронавируса, следовательно, с наибольшей вероятностью может стать мишенью обратной транскриптазы.

Чтобы подтвердить принципиальную возможность такого события, авторы провели эксперименты на клеточных культурах: в клетках HEK293T экспрессировали обратную транскриптазу из LINE-1 или ВИЧ-1, а затем инфицировали эти клетки SARS-CoV-2. Через два дня детектировали вирусные последовательности с помощью ПЦР или флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

ПЦР обнаружила участки гена N-белка в очищенной геномной ДНК клеток, при этом сигнал был сильнее, когда обратная транскриптаза находилась под более мощным промотором. В клетках, которые не инфицировали вирусом и в которые не внедряли активный ген обратной транскриптазы, сигнала не было. Из одного образца с оверэкспрессией обратной транскриптазы удалось клонировать полноразмерную последовательность гена N-белка и подтвердить ее идентичность секвенированием.

С помощью single-molecule RNA-FISH (smRNA-FISH), где использовали олигонуклеотиды, комплементарные N-гену и несущие флуоресцентную метку, авторы подтвердили, что N-последовательности интегрируются в геном и присутствуют в клеточном ядре.

Будут ли активно экспрессироваться гены LINE-1 в организме пациента? Те же наборы данных РНК-секвенирования подтверждают, что экспрессия LINE-1 активируется инфекцией SARS-CoV-2; причем возрастает и количество химерных прочтений. Авторы также показали, что экспрессия этого ретротранспозона в культуре клеток возрастает в присутствии цитокина и способствует ретроинтеграции последовательностей гена N-белка.

Эти результаты объясняют, почему пациенты могут продолжать вырабатывать вирусную РНК SARS-CoV-2 после выздоровления, отмечают авторы статьи.

Следующий вопрос: могут ли интегрированные участки вирусного генома экспрессировать вирусные белки? Если да, то могут ли эти белки вызывать иммунную реакцию и влияет ли это на течение заболевания и терапию? Авторы предполагают, что встраивание вирусных последовательностей в геном соматических клеток может быть своего рода адаптивным ответом на инфекцию: экспрессия антигена или его фрагмента способствует формированию защитного иммунитета. С другой стороны, более мощный иммунный ответ может быть разрушительным для организма. Возможно, последствия зависят от того, в каком месте генома происходит встройка, и от эпигенетической регуляции (как это было показано для ВИЧ). Так или иначе, полученные результаты открывают новый аспект инфекции SARS-CoV-2.