ДНК-сенсор для прямой детекции вирусов

В настоящее время стандартным методом детекции вируса служит ПЦР в реальном времени. При этом положительный тест на нуклеиновые кислоты вируса не всегда связан с присутствием в образце инфекционного (способного к заражению) патогена. «Золотой стандарт» для оценки инфекционности вируса — вирусологический анализ бляшкообразования — подразумевает заражение вирусом клеток в культуре. Его выполнение занимает несколько дней. Коллектив ученых из США, Германии и Аргентины предложил новый подход, позволяющий определять концентрацию инфекционного вируса в различных образцах в срок от30 минут до двух часов.

Метод объединяет в себе твердотельную нанопору и ДНК-аптамеры. Аптамеры, специфичные к вирусу, ковалентно пришиваются к полиэтилентерефталатной мембране с одиночным наноканалом. При связывании вируса с аптамером возникает электрический сигнал.

В качестве мишени выбрали человеческий аденовирус (HAdV) — безоболочечный вирус, геном которого представлен двухцепочечной ДНК. Аптамеры отбирали in vitro методом SELEX. Для создания аптамера на HAdV пул из 10¹⁵ различных последовательностей ДНК вначале подвергали отрицательной селекции: добавляли вирус, инактивированный хлором, затем удаляли вирус и все последовательности, связавшиеся с ним. После этого проводили раунд положительной селекции: добавляли инфекционный вирус и выделяли все последовательности, связавшиеся с вирусом. Полученную библиотеку, обогащенную специфичными к вирусу последовательностями, амплифицировали, и цикл повторялся. Спустя несколько циклов с помощью секвенирования ученые выявили последовательность длиной около 40 нуклеотидов — аптамер, предположительно специфичный к активному аденовирусу.

При тестировании метода в качестве контроля использовался анализ бляшкообразования. Для детекции HAdV в концентрации 1 БОЕ/мл было достаточно 30-минутной инкубации образца с нанопорой. Система позволяла количественно определять вирус в концентрации от 6 до 6x10⁴ БОЕ/мл. Кроме того, ученые детектировали от 10 БОЕ/мл HAdV в инактивированной вирусной суспензии с изначальной концентрацией 7x10³ БОЕ/мл.

Система, адаптированная для HAdV, не реагирует на вирусы других типов. В то же время она не различает серотипы вируса: натренированная на HAdV-2, она одинаково успешно детектирует также HAdV-5 и HAdV-40. Важно, что HAdV-40 плохо заражает клетки в культуре, поэтому определение его инфекционности другими методами затруднительно. Вирус можно детектировать в плазме крови и образцах питьевой воды.

На следующем этапе авторы получили аптамеры для детекции коронавируса SARS-CoV-2. Селекцию производили с помощью лентивируса, несущего S-белок SARS-CoV-2. Отрицательную селекцию проводили на том же псевдовирусе, инактивированном ультрафиолетом. В этом случае для детекции требовалась инкубация образца с нанопорой в течение двух часов. Чувствительность метода составила 1х10⁴ копий вирусных геномов на мл. Это значительно более низкий показатель, чем в случае HAdV, однако он сравним с чувствительностью ПЦР-теста.

Метод отбора аптамеров SELEX основан на различиях поверхностей вирусов, поэтому его можно проводить с псевдовирусами. Это снижает требования к уровню биобезопасности лаборатории. Предложенная система позволяет одновременно определять концентрацию и инфекционность вируса. По мнению авторов, в перспективе ее можно будет использовать как для мониторинга окружающей среды, так и для выявления заразных пациентов на ранней стадии инфекции.