Джордж Черч пытается переписать генетический код?

Расширение генетического кода — важное для синтетической биологии направление, которое позволяет вырабатывать в клетках белки со специфическими функциями и придавать организмам новые свойства. Синтез таких белков мог бы лечь в основу быстрых и дешевых инновационных решений для медицины, сельского хозяйства и множества других отраслей, однако для этого требуются значительные масштабы. Ученые нашли способы встраивать несколько неканонических аминокислот в белки, например, с помощью четырехбуквенного кода или добавления  мРНК с неканоническими кодонами и подходящей пары тРНК/аминоацил-тРНК-синтетаза (как правило, их берут от эволюционно далеких от модифицируемого организма видов).

Однако таким способом удавалось включить две-три, иногда четыре нестандартных аминокислоты. Внести подобные изменения в масштабах всего генома — сложный и трудоемкий процесс. Альтернативная идея — воспользоваться вырожденностью генетического кода, и вместо модификаций генома «переписать» систему трансляции, — описана в работе под руководством Джорджа Черча, американского генетика, известного своими громкими проектами. Исследователи из Гарвардской медицинской школы и Института Висса рассчитали, что сжатие генетического кода до всего лишь 20 смысловых кодонов, одного стартового и одного стоп-кодона освободит 14 кодонов для нестандартных аминокислот. Инструмент для реализации такого сжатия получил название AGENTEX, статья о его разработке опубликована в Nature.

Альтернативный вариант генетического кода, предложенный Черчем и его коллегами.
Credit:
Nature (2026). DOI: 10.1038/s41586-026-10949-y | CC BY-NC-ND   

На 3'-конце тРНК имеется консервативная последовательность CCA, которая необходима для распознавания как аминоацил-тРНК-синтетазами, так и рибосомами. Для получения альтернативной системы ученые предложили использовать тРНК с другим 3'-концом (CGA вместо CCA). Ключевую роль в распознавании 3'-CCA рибосомой прокариотической клетки, в данном случае кишечной палочки, играют два основания — G2251 и G2553 в 23S рРНК. Две точечных замены, G2251C и G2553C, должны обеспечить комплементарное взаимодействие с CGA 3'-концом тРНК, следовательно, рибосомы с такими мутациями будут специфично распознавать нестандартную тРНК вместо каноничной. 

Но перед тем, как направлять тРНК на распознавание рибосомой, необходимо навесить на нее нужный остаток аминокислоты. Долгое время считалось, что 3'-последовательность CCA необходима для аминоацилирования большинства тРНК. Исследователи проверили, насколько это соответствует действительности. 

Ученым предстояло разобраться с рядом трудностей — среди всех РНК транспортные подвергаются наиболее масштабным модификациям, проходя через многоступенчатое созревание. Они разработали метод tSCAN, основанный на периодатном окислении и NGS-секвенировании пулов синтетических тРНК после аминоацилирования в клеточном лизате. При обработке периодатом свободные тРНК теряют концевой аденозин, но он защищен от окисления у аминоацил-тРНК. Процесс автоматизировали на роботизированной платформе с открытым исходным кодом Opentrons OT2.

После валидации tSCAN в ортогональной системе (на тРНК архей) ученые получили библиотеку тРНК Escherichia coli с вырожденным вторым основанием в 3'-концевом триплете — CNA. Эти тРНК добавляли в лизат клеток E. coli, содержащий все природные аминоацил-тРНК-синтетазы. Анализ показал, что около 62% тРНК с 3'-концевым CGA подвергались аминоацилированию. Для вариантов с CUA и CAA на 3'-конце этот показатель составил около 42%. 

Помимо лизатов, существует и другой тип платформ для бесклеточной трансляции — смеси всех очищенных компонентов в заданной пропорции (PUREexpress). Однако авторы статьи экспериментально убедились в том, что лизаты для этой задачи эффективнее. Разница возникала из-за модификаций тРНК ферментами, которые присутствуют только в клеточных лизатах, — и в них аминоацилированию на стабильном уровне подвергались все нестандартные тРНК. 

На следующем этапе исследователи подтвердили свою гипотезу о том, что рибосомы с двумя мутациями в большой субъединице будут специфично узнавать тРНК с 3'-концевым CGA и не взаимодействовать с природными тРНК. 

Наконец, создатели AGENTEX применили свою разработку для проверки сжатого генетического кода и трансляции полипептидов. Они синтезировали минимальный пул тРНК с 3'-концевым CGA, который включал инициаторную (метиониновую) тРНК, 20 канонических — по одной на каждую аминокислоту, причем кодоны серина и аланина поменяли местами, — и тРНК археи Methanocaldococcus jannaschii. Последняя узнавала кодон UAG и несла пара-азидофенилаланин (pazF), присоединяемый его аминоацил-тРНК-синтетазой. 

Предложенная бесклеточная система трансляции позволяет тестировать альтернативные варианты генетического кода: каждый вариант синтезируется в виде набора нестандартных тРНК, которые затем вводятся в лизат, ацилируются природными ферментами и специфично узнаются модифицированными рибосомами. В том числе это позволяет создавать «сжатый» генетический код, содержащий меньше кодонов, но кодирующий больше аминокислот — по одной на кодон. По расчетам авторов, в систему можно включить до 34 разных аминоацил-тРНК-синтетаз и соответствующих кодонов.