Экспрессия Cas9 без гидовой РНК ассоциирована с риском повреждения генома

Система CRISPR-Cas9 уже продемонстрировала потенциал для лечения наследственных заболеваний человека с помощью генной терапии. Однако ее безопасность все еще вызывает ряд опасений, в том числе при использовании Cas9 без гидовой РНК. Эксперименты in vitro ранее показали, что такое применение Cas9 может приводить к геномной нестабильности, однако аналогичные исследования in vivo до этого момента не проводились. Китайские ученые оценили риски использования безгидовой Cas9 на свиньях и показали, что такая система может повреждать геном и вызывать транскриптомные изменения.

Свиньи обладают достаточным сходством физиологии и работы иммунной системы с людьми, чтобы послужить подходящей животной моделью для тестирования генной терапии. Ранее авторы работы получили свиней с доксициклин-индуцируемой экспрессией Cas9. В качестве репортера использовали tdTomato, по флуоресценции которого оценивали экспрессию целевого конструкта. Анализ клеток периферической крови методом проточной цитометрии показал, что внутрибрюшинное введение доксициклина в такой системе действительно индуцировало экспрессию нужного гена.

Дальнейшие эксперименты проводились на трех трансгенных свиньях и трех контролях дикого типа. Повреждения генома анализировали методом ДНК-комет, при котором средняя длина и количество «хвостов», формируемых при электрофорезе лизатов единичных клеток, указывают на тяжесть и степень повреждений. Анализ выявил, что введение доксициклина индуцировало повреждение ДНК у трансгенных животных, причем оно возрастало в соответствии с уровнем экспрессии Cas9 и достигало максимума на 14-й день эксперимента.

Ученые также проверили, как экспрессия Cas9 без гидовой РНК влияет на ДНК в клетках солидных органов. После предыдущего опыта они провели эвтаназию животных и проанализировали состояние тканей их желудка, кишечника, легких, почек и сердца. Результаты количественной ПЦР и иммуногистохимии подтвердили высокий уровень экспрессии Cas9 в желудке и кишечнике, умеренный — в легких и почках и низкий — в сердце. Маркер повреждений ДНК pH2AX при этом был мало представлен в сердце, но чаще встречался в остальных органах, что согласуется с паттерном экспрессии Cas9. Кроме того, окрашивание на CASP3 (маркер апоптоза) выявило наличие апоптотических клеток в желудке и кишечнике свиней, получавших доксициклин.

Последствия экспрессии Cas9 без гидовой РНК изучили также на транскриптомном уровне. Для этого авторы отсеквенировали РНК периферических мононуклеарных клеток крови свиней на 0-й и 14-й день индукции доксициклином. Анализ выявил значительное изменение протеомного профиля на 14-й день — 2003 гена стали экспрессироваться активнее, уровень еще 1730 снизился. Эти дифференциально экспрессируемые гены преимущественно относились к путям, связанным с ответом на повреждение ДНК (в т.ч. сенесценция клеток, убиквитин-опосредованный протеолиз, апоптоз, митофагия и сигналинг P53), а также с регуляцией иммунного ответа.

Аналогичным образом исследователи оценили транскриптомные изменения в тканях органов. В желудке и кишечнике активировались гены, связанные с апоптозом, паракринным старением, восстановлением повреждений ДНК и остановкой клеточного цикла.

Длительная экспрессия Cas9 в отсутствие гидовой РНК вызывала также фенотипические изменения у животных — нарушение функций ЖКТ и потерю веса.

Наконец, ученые проверили, влияет ли длительная экспрессия Cas9 на частоту возникновения мутаций. Они сравнили результаты полногеномного секвенирования тканей с самой высокой (желудок) и самой низкой (сердце) экспрессией Cas9. Оказалось, что число геномных мутаций при доксициклин-индуцируемой экспрессии Cas9 было намного выше, чем в контроле. Авторы подчеркивают: несмотря на то, что опухоли у животных не сформировались, активация мутагенеза затронула несколько ключевых генов, способствующих развитию опухолей.

Таким образом, авторы исследования впервые проанализировали риски, связанные с экспрессией Cas9 в организме крупных животных. Они показали, что экспрессия этого белка в организме свиней приводила к повреждениям генома, изменяла транскриптом тканей и увеличивала частоту мутаций. Полученные результаты подчеркивают еще один важный фактор риска, который необходимо учитывать в клинических испытаниях генной терапии.

Редактирование генома эмбрионов с помощью CRISPR-Cas9 приводит к повреждениям хромосом