Электрохимический экспресс-тест выявляет однонуклеотидные полиморфизмы в крови

Остеопороз — хроническое прогрессирующее заболевание, из-за которого постепенного разрушается костная ткань, повышается риск переломов. От остеопороза в Европе страдают более 50% женщин и 30% мужчин старше 50 лет. Существующие методы диагностики позволяют обнаружить заболевание только на тех стадиях, когда уже имеются значительные повреждения костей. Международная группа ученых разработала тест-систему, позволяющую выявить предрасположенность к развитию остеопороза по ДНК капиллярной крови.

В 2018 году были определены 15 локусов, ассоциированных с переломами на фоне пониженной плотности костей. В этих 15 локусах отобрали четыре однонуклеотидных полиморфизма (SNP), связанных с генами, участвующими в формировании костей: WNT16 (rs2908007), RSPO3 (rs10457487), FAM210A (rs4635400) и SOST (rs2741856); эти четыре SNP определяют наибольшую долю риска переломов. Ученые дополнили свою аналитическую систему маркером непереносимости лактозы (LCT(C/T-13910); rs4988235) — это состояние может быть дополнительным фактором предрасположенности к остеопорозу.

Существует широкий спектр методов для обнаружения SNP, включая микрочипы, конкурентную аллель-специфичную ПЦР и секвенирование, однако они отличаются высокой стоимостью и требуют времени. Авторы работы утверждают, что их тест-система позволяет провести анализ менее чем за 20 минут, а стоимость одного теста составит около 0,5 доллара.

Система, предложенная авторами в 2022 году, основана на изотермической твердофазной рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA). Этот вариант изотермической амплификации особенно привлекателен для разработки методов анализа «у постели больного», поскольку требует всего двух праймеров на одну мишень (в отличие, например, от LAMP), реакция идет при низких температурах (22–45 °C) с высокой скоростью и нечувствительна к ингибиторам ПЦР, что позволяет исключить этапы очистки.

Как альтернативу флуоресцентной детекции продукта реакции авторы использовали электрохимическую детекцию. Четыре идентичных 5'-тиолированных праймера, отличающихся только 3' концевым основанием, самособираются на золотых электродах микрочипа. Концевое основание предназначено для специфического связывания с основанием в исследуемом сайте SNP (таким образом, только один из четырех праймеров полностью комплементарен мишени). При связывании с комплементарным участком в геномной ДНК праймер удлиняется. На электроде закреплены обратные праймеры, а прямые праймеры находятся в растворе. Смесь реагентов для амплификации содержит дезоксирибонуклеотиды, меченные ферроценом. Ферроцен в составе новой цепи ДНК играет роль электроактивного маркера; реакция амплификации на электроде детектируется методом прямоугольной вольтамперометрии.

Ранее авторы уже детектировали SNP, связанные с кардиомиопатией, и детерминанты устойчивости к рифампицину у возбудителя туберкулеза. В новой работе платформа расширена для одновременной детекции пяти мишеней.

В качестве отрицательного контроля используются электроды с 5'-тиолированными обратными праймерами, 3' концевые основания которых не специфичны для SNP. Кроме того, в системе есть два положительных контроля: электрод, определяющий наличие гена β-глобина, положительный сигнал от которого говорит о том, что реакция протекает нормально, и электрод, необходимый для контроля исправности всей системы в целом.

Предполагается, что для анализа будет использоваться кровь, подвергнутая термическому лизису. Разработчики проверили, может ли влиять на сигнал какие-либо компоненты крови, сравнив результаты анализа образцов крови и очищенной геномной ДНК. Они пришли к выводу, что анализ действительно можно проводить в образце крови без этапа экстракции.

Эффективность своей методики авторы подтвердили эталонными методами: провели SNP-специфический анализ, требующий предварительного выделения и очистки ДНК, а также секвенирование образцов крови по Сэнгеру. Результаты обоих методов соответствовали данным, полученным с помощью электрохимической системы.

Предложенная методика, по утверждению авторов, может стать полезным вспомогательным инструментом при ранней диагностике остеопороза, но не самостоятельным диагностическим средством, поскольку определяет лишь риск развития заболевания. Кроме того, платформа может использоваться для генотипирования любых SNP, количество которых можно легко увеличить без существенного влияния на стоимость анализа.

Состав микробиома мышей связан с минеральной плотностью костной ткани в условиях микрогравитации