Факторы риска рака мочевого пузыря, в том числе пол и курение, влияют на клональный ландшафт уротелия

Мужчины и курящие люди чаще болеют раком мочевого пузыря. До сих пор было неясно, почему пол влияет на риск развития этого типа рака, а также не до конца была понятна роль курения. Оно может являться как исключительно мутагенным фактором (увеличивающим число мутаций), так и стимулировать рост уже мутантных клеток. Чтобы разобраться в этом, ученые из Института биомедицинских исследований Барселоны и Университета Вашингтона охарактеризовали клональный ландшафт нормального уротелия (эпителия мочевого пузыря). Обнаружение мутантных клонов в нормальной ткани затруднено, поскольку эти клоны, как правило, очень малы и ускользают от обнаружения стандартными методами секвенирования.

Ученые использовали сверхглубокое секвенирование ДНК (ultradeep DNA duplex sequencing), которое позволяет обнаружить мутации с чрезвычайно низкой частотой. Было проанализировано 79 образцов нормального уротелия, полученных с помощью щеток с двух областей мочевого пузыря (купола и треугольника) у 45 умерших доноров.

В первую очередь авторы проанализировали 15 генов, которые, находятся под влиянием положительного отбора в уротелии и (или) часто мутируют при карциномах мочевого пузыря, а также промотор гена TERT (кодирует теломеразу). Благодаря сверхглубокому секвенированию (в среднем около 5000x на образец) было идентифицировано около 400 000 гаплоидных геномов и обнаружено в общей сложности 64 278 мутаций. Эта цифра примерно в 16 раз превышает количество мутаций, выявленных в тех же генах в 892 опухолях мочевого пузыря, собранных за десятилетие исследований.

Для количественной оценки скорости роста клонов под действием мутаций исследователи использовали вычислительный подход, основанный на соотношении dN/dS (отношение несинонимичных и укорачивающих белок мутаций к синонимичным), чтобы определить силу положительного отбора для каждого гена в каждом образце. Этот показатель позволяет выявить так называемые драйверные мутации, то есть те, что дают клетке преимущество в росте.

Анализ показал, что возраст ожидаемо связан с увеличением плотности мутаций и усилением положительного отбора. Однако при учете возраста и других факторов риска (курение, ИМТ, воздействие химиотерапии) были выявлены явные различия, обусловленные полом и курением.

Исследование выявило, что мужчины имеют значительно больше драйверных мутаций, приводящих к преждевременному обрыву синтеза белка (truncating driver mutations), в генах RBM10, CDKN1A и ARID1A, чем женщины. Этот результат указывает на более сильный положительный отбор таких мутаций в этих генах в уротелии мужчин. Примечательно, что гены RBM10 и CDKN1A также чаще обнаруживаются мутированными в опухолях мочевого пузыря у мужчин, чем у женщин. Обнаруженные различия позволяют предположить, что эволюционная динамика и избирательное давление в уротелии мужчин и женщин отличаются. Ученые предполагают, что это может быть связано с различиями во внутренних факторах, например, половых гормонах, или с внешними факторами, которые непропорционально затрагивают мужчин.

Еще один вывод касается роли курения, которое является основным фактором риска. Было обнаружено, что активирующие мутации в промоторе гена TERT (те, которые наблюдаются в опухолях) стимулируют клональные экспансии в нормальном мочевом пузыре. Эти активирующие мутации TERT были ассоциированы с возрастом и историей курения. Почти все активирующие мутации промотора TERT были обнаружены у доноров старше 55 лет. В этой возрастной группе доноры, которые когда-либо курили, имели значительно более высокую частоту таких мутаций, чем некурящие.

Важно отметить, что история курения не была связана с общим увеличением плотности мутаций по всем образцам. Вместо этого наблюдалось специфическое увеличение частоты TERT-активирующих мутаций. Этот факт указывает на то, что канцерогены табака играют роль скорее промотора, то есть они способствуют росту клонов, несущих эти мутации, а не просто увеличивают общее количество мутаций (мутагенез). Таким образом, воздействие табачных канцерогенов на нормальный уротелий может повышать риск рака мочевого пузыря именно через стимуляцию роста клонов с мутациями промотора TERT.

Полученные результаты объясняют, как известные факторы риска рака мочевого пузыря (мужской пол и курение) влияют на раннюю эволюцию ткани. Кроме того, методологический подход, примененный в работе, открывает широкие возможности для фундаментальной науки. Высокое число идентифицированных мутаций в нормальной ткани с помощью сверхглубокого секвенирования позволяет реализовать концепцию естественного мутагенеза с насыщением (natural saturation mutagenesis).

В отличие от опухолей, где, как правило, наблюдаются одна или две драйверные мутации на ген, в поликлональных нормальных образцах обнаруживается множество драйверных мутаций, которые стимулируют экспансию различных клонов. Изучая естественное накопление и отбор мутаций in vivo в нормальной ткани, можно получить карту селективного давления, действующего на мутации на уровне отдельных сайтов или доменов белка.

Этот подход — экономически эффективная альтернатива экспериментальным и in silico методам определения функционального воздействия мутаций и поможет в разработке персонализированной медицины. Характеристика паттернов положительного (и отрицательного) отбора в различных генах и тканях имеет решающее значение для понимания того, как соматическая эволюция влияет на риск развития рака. В данном исследовании, например, было обнаружено, что нонсенс-мутации в FGFR3 находятся под отрицательным отбором в нормальном уротелии, хотя в опухолях они часто наблюдаются.

Ученые подчеркивают, что дальнейшее масштабирование этого метода, возможно, путем использования малоинвазивных методов, таких как анализ образцов мочи или лаважей, позволит более глубоко исследовать влияние других факторов риска на клональный ландшафт уротелия.

Базальные клетки эпителия бронхов курильщиков накапливают мутации и становятся источником опухоли