Фрагмент белка коронавируса, созданный для исследований, чувствителен к холоду

Ученые из США показали, что стабилизированный эктодомен S-белка SARS-CoV-2, который используют в лабораторных экспериментах, может денатурировать при низких температурах. Это влияет на его способность связывать антитела и клеточные рецепторы. Чтобы результаты исследований с этим эктодоменом хорошо согласовались между собой, авторы предлагают хранить образцы в аликвотах после мгновенной заморозки, с последующей разморозкой и инкубацией при 37 °C.

Изображение:

Эктодомен S-белка коронавируса (тример); рецептор- связывающий домен в конформации «вверх» показан зеленым цветом

Credit:

Science, 2020: DOI: 10.1126/science.abb2507

S-белок SARS-CoV-2 опосредует связывание рецептора и проникновение вируса в клетку; S-белок, его ген или мРНК входят в состав многих вакцин. Для структурных исследований и разработки вакцин были созданы стабилизированные конструкты эктодоменов S-белка, которые связывают клеточный рецептор и распознаются антителами, как и нативный белок вируса. Чаще всего используется конструкт 2P S с двумя пролиновыми заменами на C-конце S2 домена, мотивом для тримеризации и мутацией, которая не позволяет протеазе фурину разрезать белок. (Первое исследование структуры S-белка с использованием подобного конструкта было опубликовано еще в феврале 2020 года.) Рецептор-связывающий домен конструкта, как и полноразмерного S-белка, может находиться в двух конформациях — «вверх», при которой возможно присоединение к рецептору, и «вниз», при которой оно невозможно. Были получены сведения, что 2P S чувствителен к низким температурам. Ученые из США проверили, так ли это.

Структуру 2P S изучили при разных температурах. Для этого использовалась электронная микроскопия с негативным окрашиванием (NSEM). Сразу после приготовления образцов 2P S в среднем 75% из них формировали правильные «шипы» коронавируса. После одного цикла заморозки/разморозки этот показатель падал до 64%. Хранение при комнатной температуре в течение 5-7 дней снижало показатель до 59%, а хранении в течение того же времени при 4 °C — до 5%. С другой стороны, после инкубации при 37 °C в течение недели показатель составлял 83%. Если после недельного хранения при 4 °C препарат 2P S подвергали трехчасовой инкубации при 37 °C, структура и показатель формирования «шипов» восстанавливались практически до первоначального состояния.

Анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE анализ) и дифференциальная сканирующая флуориметрия (DSF) подтвердили полученные данные и показали, что структурные изменения не связаны с деградацией белка. Кроме того, замена буфера продемонстрировала, что на них не влияет и pH раствора.

Чтобы проверить, как влияет режим хранения на связывание 2P S с лигандами, использовали методы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и иммуноферментного анализа (ИФА). После хранения при 4 °C 2P S лучше связывался с антителом CR3022 и рецептором ACE-2, но хуже — с антителом 2G12. Заморозка при −80°C с последующим оттаиванием также повышала связывание 2P S с CR3022, но инкубация при 37 °C в течение 20 минут нивелировала эффект. Эти данные говорят о том, что температурная денатурация белка повышает доступность рецептор-связывающего домена.

Авторы создали конструкт rS2d-HexaPro с мутацией HexaPro, в котором рецептор-связывающий домен находился в конформации «вниз». Такой конструкт не подвергался температурной денатурации, но и рецептор ACE-2, как и ожидалось, связывал хуже.

Таким образом, при использовании конструкта 2P S в исследовательских целях необходимо учитывать температурный режим хранения. Для достижения согласующихся результатов авторы рекомендуют мгновенную заморозку аликвот конструктов с последующей разморозкой и двадцатиминутной инкубацией при 37 °C.

Источник

Edwards R. et al.//Cold sensitivity of the SARS-CoV-2 spike ectodomain//Nature Structural & Molecular Biology (2021), published 05 January 2021. DOI: 10.1038/s41594-020-00547-5

Добавить в избранное

Вам будет интересно