Генное редактирование сделало рис устойчивым ко многим патогенам

За последнее десятилетие методы генного редактирования CRISPR-Cas очень сильно расширили возможности ученых и биотехнологов. В то же время работ по целенаправленному улучшению сельскохозяйственных культур с их помощью пока сравнительно мало.

Международный коллектив ученых использовал систему CRISPR-Cas для изменения генома риса (Oryza sativa). Это чрезвычайно важная культура, которую регулярно употребляет в пищу половина населения Земли. При этом рис страдает он многих фитопатогенов, в том числе возбудителя пирикуляриоза (грибка Magnaporthe oryzae), что ежегодно приводит к потере значительной части урожая.

Чтобы сделать рис устойчивее, ученые обратили внимание на так называемые гены LMM (lesion mimic mutant, «имитирующий повреждения»). Они связаны с гиперчувствительностью риса, при которой характерные для инфекции повреждения возникают без контакта с патогеном. Такие растения к тому же устойчивы к фитопатогенам, но имеют очень низкую урожайность.

Для поиска новых генов LMM авторы рассмотрели более 1500 геномов риса сорта Kitaake, подвергшихся радиационному мутагенезу. Один из найденных генов (RBL1) вызвал повышенный интерес, поскольку он связан с устойчивостью одновременно к грибку M. oryzae и патогенной бактерии Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Мутантные растения rbl1 вырабатывали больше активных форм кислорода, накапливали салициловую кислоту и активировали гены, которые необходимы для защиты от инфекций.

Далее ученые получили полные геномы растений-мутантов rbl1 и установили связь фенотипа LMM с делецией размером 29 пар оснований в гене RBL1. Данная мутация затрагивает экзон 9 гена и соседний интрон, в результате рамка считывания сохраняется, но белковый продукт становится короче на 19 аминокислот. Изменяется в том числе область, связывающая ион железа. RBL1 экспрессировался во всех изученных тканях, особенно его было в листьях, и его экспрессию вызывала инфекция.

Работа гена RBL1 была изучена с помощью гетерологической экспрессии на дрожжах. В результате в клетках гриба повысилось содержание фосфатидиловой кислоты, а концентрации фосфатидилинозитола и фосфатидилглицерина упали.

Далее методы липидомики подтвердили роль белка RBL1 в физиологии риса. Оказалось, полученные мутации увеличили содержание фосфатидиловой кислоты и диацилглицерола в растении и снижали уровни фосфатидилинозитола и фосфатидилглицерина (на 71% и 49% соответственно). Экзогенный фосфатидилинозитол замедлял формирование фенотипа с повреждениями, как и его оверэкспрессия.

С помощью блоттинга с антителами, специфичными к фосфатидилинозитолфосфату (PtdInsP₂), было показано, что у растений rbl1 в мембранах меньше фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата (PtdIns(4,5)P₂). Далее авторы создали новую линию трансгенного риса, экспрессирующего биосенсор к PtdIns(4,5)P₂. Оказалось, что, в отличие от растений дикого типа, растения rbl1 почти не содержат этого фосфатидилинозитола в плазмалемме, однако он имеется в неизвестных клеточных везикулах. Флуоресцентные метки позволили узнать, что при заражении M. oryzae молекулы PtdIns(4,5)P₂ окружают гифы грибка и изолируют их.

Все это может быть связано с устойчивостью растений rbl1 к патогенам. Однако их возделывание на полях лишено смысла из-за сниженной в 20 раз урожайности. Чтобы это изменить, авторы использовали гидовые РНК и мультиплексное геномное редактирование CRISPR-Cas для того, чтобы таргетировать различные сайты гена RBL1. Среди полученных линий 38 имели заметный фенотип LMM и сниженное число семян, они сильно напоминали линию rbl1. В то же время одна из линий с делецией размером 12 пар оснований — RBL1Δ12 — имела нормальное число зерен при фенотипе LMM.

Растения риса RBL1Δ12 продемонстрировали устойчивость к десяти штаммам M. oryzae, пяти штаммам Xoo и двум штаммам ложной головни Ustilaginoidea virens. В последнем случае также было отмечено падение уровня микотоксинов в тканях растения.

Наконец, авторы провели небольшие полевые испытания риса RBL1Δ12 в трех провинциях Китая. Были охарактеризованы различные агрономические признаки растений, которые (за исключением меньшей высоты) соответствовали норме. При этом на опытных площадках новый рис подтвердил свою высокую устойчивость ко многим инфекциям.

Сорный рис получил устойчивость к гербицидам путем гибридизации с культурным рисом