Генотерапия ослабила симптомы паркинсонизма у макак и мышей

Болезнь Паркинсона — широко распространенное нейродегенеративное заболевания, диагностированное более чем у шести миллионов человек. Тяжелые нарушения двигательной функции, характерные для этой болезни, связаны с гибелью дофаминергических нейронов экстрапирамидной системы, однако многие детали патогенеза еще предстоит выяснить. Как правило, терапию болезни Паркинсона проводят с помощью леводопы (предшественника дофамина) или агонистов дофаминовых рецепторов. Эти препараты оказывают не только целевой эффект, направленный на нейроны базальных ганглиев, — они влияют на разные области центральной и периферической нервной системы. С этим связаны их многочисленные побочные эффекты.

Авторы публикации в Cell поставили цель избирательно таргетировать один из фенотипов дофаминергических нейронов — средние шипиковые нейроны стриатума, экспрессирующие D1-рецепторы (D1-MSN). Эти нейроны — единственный тип клеток стриатума, иннервирующий черную субстанцию (точнее, ее сетчатую часть — substantia nigra pars reticulata), которая особенно важна при болезни Паркинсона. Поэтому они представляют собой очень удобную мишень для терапевтических подходов к этому заболеванию. Так, уже известно, что селективная активация нейронов стриатума, экспрессирующих дофаминовые рецепторы D1 (D1-MSN), эффективно снижает основные нарушения моторики у грызунов, моделирующих болезнь Паркинсона.

Ученые использовали аденовирусные конструкты (AAV), которые сочетали три компонента: капсиды ретроградного AAV, избирательно инфицирующего аксоны; промотор и/или энхансер, регулирующий тканеспецифичную экспрессию нужного гена; хемогенетический эффектор, который позволяет управлять работой модифицированных нейронов извне.

Для начала авторы получили модифицированный капсид AAV, обеспечивающий максимально эффективное ретроградное распространение вируса — его проверяли на мышиной модели. С этой целью они внесли многочисленные мутации в белки капсидов разных серотипов аденоассоциированных вирусов. Наиболее успешное заражение MSN после введения в черную субстанцию показал полученный капсид AAV8R12 — почти в 8 раз эффективнее, чем исходный вариант.

Далее ученые создали оптимальный промотор. На основании базы данных они выделили восемь кандидатных промоторных областей, отличающихся высокой активностью в полосатом теле (по сравнению с базальными ганглиями в целом). Их экспрессию оценивали с помощью репортерного гена, кодирующего флуоресцентный белок. Максимальную активность в MSN показал промотор гена GPR88, поэтому его использовали в качестве основы для получения двух укороченных промоторов G88P3 и G88P7 — они обладали сравнимой эффективностью. При доставке таких промоторов в капсиде AAV8R12, которую авторы проводили на мышах, 97,68% таргетированных нейронов находились в полосатом теле.

Схожий результат исследователи получили на макаке-крабоеде (Macaca fascicularis) — рекомбинантная конструкция с флуоресцентной меткой эффективно таргетировала хвостатое ядро и скорлупу головного мозга.

Авторы также добились активации нейронов с помощью искусственных рецепторов, активируемых исключительно синтетическими лигандами (DREADD). Сначала они использовали модифицированный мускариновый рецептор hM3Dq, который активируется метаболитом антипсихотического препарата — клозапин-N-оксидом (CNO). Введение CNO действительно активировало D1-MSN и влияло на поведение животных, однако для большей специфичности авторы решили заменить используемый рецептор.

В качестве замены они использовали другой рецептор — rM3Ds, — который действует на вторичный мессенджер cAMP и активирует нейроны MSN в полосатом теле, но не черной субстанции, после системного введения CNO. Ученые подтвердили это в экспериментах на мышах с помощью иммуногистохимического окрашивания и гибридизации in situ. Электрофизиологические эксперименты показали увеличенную возбудимость трансдуцированных аденовирусом MSN при введении CNO. Высокая эффективность и точность модификации нейронов отмечена и у макак — клетки популяции D1-MSN активировались под действием CNO.

Далее препарат протестировали на животной модели болезни Паркинсона. Мышам в полосатое тело вводили 6-гидроксидофамин (6-OHDA), что привело к нарушению дофаминергической иннервации и гибели нейронов черной субстанции (точнее, ее компактной части — substantia nigra pars compacta). У животных развились брадикинезия, тремор, ригидность и нарушения осанки.

Активация D1-MSN при помощи разработанной авторами системы снизила брадикинезию и другие симптомы у мышей, что подтвердило тестирование на вращающемся цилиндре для бега.

В случае макак симптомы паркинсонизма вызвали с помощью инъекций 1-метил-4-фенилпиридиния (MPP+) в ту же область черной субстанции — это создало картину заболевания, близкую к той, что наблюдалась в мышиной модели. Затем макакам стереотаксически вводили аденовирусный препарат в 9 участков черной субстанции, а для его активации использовали десхлороклозапин (DCZ) — другой мощный агонист используемых DREADD, который хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер и действует специфичнее, чем CNO. Электрофизиологические исследования in vivo подтвердили, что активатор избирательно действует на целевые нейроны макак. Препарат заметно снизил основные симптомы паркинсонизма — эффект сохранялся в течение восьми месяцев, в ходе которых животные получали DCZ. Кроме того, такое лечение не вызывало дискинезии, характерной для длительной терапии леводопой.

В отличие от лечения леводопой, которая неспецифически активирует дофаминовую систему как в головном мозге, так и в периферических органах, новый подход избирательно воздействует на D1-MSN, благодаря чему не вызывает характерных для леводопы побочных эффектов. Авторы отмечают, что, помимо терапии болезни Паркинсона, предложенный ими генотерапевтический подход может стать ценной стратегией для лечения других заболеваний нервной системы.

Препараты от гиперплазии простаты могут предотвратить болезнь Паркинсона