Гибридные гидРНК минимизируют нецелевое редактирование генов in vivo

Генная терапия на основе CRISPR-редактирования — многообещающее направление в современной медицине для эффективного и точного исправления патогенных мутаций непосредственно в теле пациента. Один из ее инструментов — это редакторы адениновых оснований (ABE), которые катализируют точечную замену аденина (А) на гуанин (G) в ДНК. Это позволяет исправить значительную долю известных патогенных вариантов у человека, и недавние успехи в клинических испытаниях, например, по инактивации гена PCSK9 для снижения холестерина в печени, подтвердили высокую эффективность ABE. Однако, как и любая технология редактирования генома, ABE сталкиваются с двумя основными проблемами безопасности — нецелевое редактирование (off-target) и «пассажирские» мутации (bystander). 

Авторы статьи в Nature Biomedical Engineering предложили способ повысить безопасность редактирования оснований in vivo, не снижая его эффективности. Стратегия основана на использовании гибридных гидовых РНК (гидРНК), в которых некоторые рибонуклеотиды в спейсерной последовательности заменены на дезоксирибонуклеотиды. 

Повышения безопасности терапии авторы добились через снижение нецелевого редактирования клинически значимыми гидРНК. Сначала они систематически оценили влияние гибридных гидРНК на профили редактирования с помощью ABE 8.8 (редактора восьмого поколения с наиболее узким окном редактирования). Для редактирования выбрали гены, связанные с тяжелыми моногенными заболеваниями — фенилкетонурия, вызванная вариантами в гене PAH (например, P281L и R408W), и эластическая псевдоксантома, связанная с вариантом R1164X в гене ABCC6. Также в исследование включили ген HPD, варианты в котором — один из двух генетических факторов наследственной тирозинемии 1 типа. 

Работа началась с обширного скрининга in cellulo, то есть на единичных клетках (гомозиготных гепатоцитах HuH-7 человека). Для коррекции варианта PAH P281L — причины фенилкетонурии — авторы синтезировали 21 вариант гибридной гидРНК с одним, двумя или тремя дезоксирибонуклеотидами в спейсере. 

Для оценки профилей безопасности ученые использовали метод ONE-seq (OligoNucleotide Enrichment and sequencing), который специально разработан для выявления нецелевого редактирования редакторами оснований. 

Большинство гибридных гидРНК сохраняли высокую эффективность целевого редактирования (90%). Однако большинство из них также существенно снизили уровень нецелевого — до 1% по сравнению с 4,4% для стандартной гидРНК. Комбинируя замены в гибридной гидРНК, авторы добились полного устранения нецелевого редактирования в гене PAH1. При использовании гидовой РНК PAH1_hyb24 они детектировали ноль нецелевых сайтов в мишени. 

Исследователи провели уникальный анализ ONE-seq, учитывающий генетические варианты (variant-aware ONE-seq). Это необходимо, поскольку природные генетические вариации могут создавать новые, непредсказуемые нецелевые сайты у некоторых пациентов. Результаты показали, что гидРНК PAH1_hyb24 устранила потенциальное нецелевое редактирование во всех проанализированных вариабельных сайтах. 

Аналогичные результаты исследователи получили при оптимизации гидРНК (PXE1) для коррекции варианта R1164X в гене ABCC6 — причины эластической псевдоксантомы. В клеточных моделях гибридные гидРНК повысили эффективность целевого редактирования (до 50%), а также снизили частоту нецелевых замен редактирование и «пассажирских» мутаций. Метод оправдал себя и в случае гена HPD, связанного с наследственной тирозинемией. 

Ключевым этапом стало тестирование наиболее перспективных гибридных гидРНК на гуманизированных мышах. Опыты проводили на мышиной модели фенилкетонурии, вызванной вариантом P281L в гене PAH. С помощью липидных наночастиц — стандарта для доставки in vivo — авторы доставляли в печень животных мРНК ABE8.8 и гибридные гидРНК.
Использование гибридных гидРНК не только не снизило эффективность, но и значительно улучшило целевое редактирование в печени мышей. Средний уровень корректирующего редактирования составил 50-60% при использовании гибридных гидРНК, в то время как для стандартной гидРНК он был на уровне 40%. С точки зрения клинического эффекта, гибридные гидРНК привели к полной нормализации уровня фенилаланина в крови уже через 48 часов — это значительно превзошло результаты, полученные со стандартной гидРНК. Улучшение наблюдалось и в профиле безопасности — частота пассажирских мутаций сократилась с 0,8% до 0,2–0,3%. Нецелевое редактирование в сайте PAH1_mOT3, достигавшее 2,1% в контроле, снизилось до менее чем 0,2% при применении гибридных гидРНК. 

Аналогичные положительные результаты были получены и в модели эластической псевдоксантомы, связанной с вариантом R1164X гена ABCC6. Применение гибридной гидРНК повысило средний показатель целевого редактирования с 24% до 29%, и терапия обеспечила нормализацию уровня пирофосфата в крови мышей. Нецелевое редактирование в мышином сайте PXE1_mOT24 снизилось с 8,4% при использовании стандартной гидРНК до 0,6% при использовании PXE1_hyb18. 

Использование гибридных гидРНК, таким образом, повысило безопасность и эффективность генной терапии редакторами оснований. Преимущества гибридных гидРНК подтвердились на девяти различных локусах in cellulo и двух локусах in vivo. Исходя из того, что подход к лечению фенилкетонурии с помощью комбинации ABE8.8/PAH1_hyb24 оказался высокоэффективным и безопасным in vivo, ученые намерены перейти к клиническим испытаниям. 

Хотя оптимальная модификация гидРНК может зависеть от целевого локуса, ученые выявили определенные конструкции, которые могут служить разумной отправной точкой для быстрого скрининга в будущих разработках, включая персонализированные терапии для ультраредких заболеваний.

Редактор оснований исправил мутацию, вызывающую редкое сосудистое заболевание