Гиперчувствительный mTOR запускает регенерацию конечностей у аксолотля

Восстановление поврежденных тканей остается одной из крупнейших проблем современной медицины. Большинство млекопитающих имеют крайне низкий регенеративный потенциал. В то же время некоторые хвостатые амфибии способны регенерировать целые конечности и даже органы. Новое исследование ученых из США показало, что один из ключей к регенеративной способности аксолотля — повышенная чувствительность киназы mTOR.

Регенерация конечности у аксолотля сопровождается быстрым закрытием раны с дальнейшим формированием бластемы — массы стволовых клеток, дающих начало новой конечности. Для оценки роли синтеза белков в процессе регенерации авторы использовали центрифугирование в градиенте сахарозы — метод, позволяющий разделить молекулы мРНК по количеству связанных с ними рибосом. Через 24 часа после ампутации конечности у аксолотля на месте травмы значительно повышалось число фрагментов мРНК, несущих три или более рибосом, что свидетельствует об активном синтезе белков. В то же время при ампутации пальцев у мышат изменений в количестве связанных с мРНК рибосом не наблюдалось. Исследователи также использовали специальный краситель, встраивающийся в синтезируемые белки. Окраска подтвердила значительное повышение синтеза белков во всех тканях конечности аксолотля уже ко второму часу после ампутации. Данный эффект опять-таки не наблюдался у мышей.

Авторы разработали протокол секвенирования, позволяющий классифицировать мРНК по количеству связанных рибосом (в образцах, взятых сразу после ампутации и через 24 часа, разделяли транскрипты, «свободные» от рибосом, «легкую» и «тяжелую» фракции и секвенировали по отдельности, а затем сравнивали с тотальной мРНК). Всего удалось идентифицировать 8139 мРНК. Из них 17,3% к 24 часу после ампутации связывали значительно больше рибосом. Примечательно, что для 504 мРНК наблюдалось увеличение числа ассоциированных рибосом без увеличения уровня транскрипции (т.е. числа самих мРНК) — иначе говоря, в ответ на травму активировалась трансляция мРНК, уже находящихся в тканях. Эти мРНК были ассоциированы преимущественно с эпителиальными клетками, а мРНК с повышенной транскрипционной активностью — преимущественно с иммунными клетками.

Анализ генной онтологии показал, что трансляционнно активированные мРНК связаны преимущественно с синтезом белков, в частности, по такому пути активировалась продукция рибосомных белков, факторов инициации трансляции, лигаз, присоединяющих аминокислоты к тРНК. Известно, что трансляция рибосомных белков и факторов инициации трансляции напрямую регулируется через сигнальный путь mTOR. Авторы также обнаружили транскрипционную активацию большого числа мРНК, связанных с данным сигнальным путем. Это позволило предположить, что киназа mTOR играет ключевую роль в регенерации. И действительно, некоторые молекулярные маркеры активации сигнального пути линейно повышались в течение 24 часов после ампутации конечности.

Для дополнительного подтверждения роли mTOR в регенерации авторы ингибировали его работу после ампутации конечности. Это значительно замедляло затягивание раны и дальнейшие процессы регенерации. Более того, эффект наблюдался даже в том случае, если mTOR ингибировали после затягивания раны, — даже начиналась регрессия уже сформировавшихся новых тканей, что свидетельствует о необходимости продолжительной активации mTOR. Использование специфичных ингибиторов показало, что ключевую роль в процессах регенерации играет комплекс mTORC1, а не mTORC2.

mTOR аксолотля высококонсервативен — 84% аминокислот совпадают с человеческими и мышиными ортологами. Однако в белке аксолотля присутствуют две важные инсерции, одна из которых также имеется у других представителей класса, а вторая уникальна для хвостатых амфибий. Обе инсерции находятся в функционально значимом регионе M-HEAT и, по результатам структурного моделирования, могут улучшать контакт этого региона с другими. Вторая инсерция предположительно повышает стабильность димера mTOR.

Чтобы выяснить, как влияют инсерции на функцию mTOR, исследователи получили при помощи CRISPR-Cas9 гибридные человеческие mTOR, несущие инсерции аксолотля. В клеточных культурах гибридные комплексы локализовались в лизосомах — явление, наблюдаемое в предыдущих опытах у аксолотлей, но не у мышей и предположительно обеспечивающее более быструю активацию сигнального пути. При титровании аминокислотами (повышение уровня аминокислот и других питательных веществ стимулирует mTOR) гибридные комплексы продемонстрировали повышенную чувствительность в сравнении с человеческим mTOR, активируясь при значительно меньших концентрациях.

Таким образом, один из ключевых механизмов, задействованных в регенерации конечностей у аксолотля, — это активация синтеза белков через mTOR, который, в свою очередь, у этого вида активируется легче, нежели ортологи у млекопитающих. Получение гибридных mTOR может открыть новые возможности для улучшения заживления ран и, возможно, даже для регенерации тканей без риска онкогенных трансформаций.

Регенерация конечностей у саламандр не повторяет эмбриональное развитие

Что нужно тритону, чтобы отрастить конечность