Гранзим А как биомаркер воспалительных заболеваний кишечника

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) — хронические иммуноопосредованные расстройства, для которых характерно воспаление желудочно-кишечного тракта. На развитие и прогрессирование ВЗК влияют генетические и иммунологические факторы, а также факторы окружающей среды. Излечение на данный момент невозможно, а терапия направлена в основном на подавление воспалительных процессов. Поэтому для улучшения состояния пациентов необходимы методы мониторинга иммуноопосредованного воспаления. Диагностика ВЗК основывается на клиническом обследовании, методах визуализации, колоноскопии и гистологическом анализе биопсий, а упростить процесс за счет биомаркеров невозможно из-за их неспецифичности.

Исследователи из Великобритании, Израиля и Нидерландов предложили измерять иммунную активность в кишечнике, а в качестве целевой молекулы взять гранзим А. (Связь гранзимов с воспалением кишечника была показана на мышиной модели колита.) А для определения гранзима авторы работы предложил взять разработанный ими хемилюминесцентный репортер (GzmA-CL). Они дополнительно разработали селективный ингибитор гранзима А — GzmA-INH.

Ранние исследования позволили авторам предположить, что уровень экспрессии гранзима А коррелирует с воспалением кишечника. Они проанализировали данные по экспрессии гена GZMA у более чем 800 пациентов с ВЗК. Действительно, уровень экспрессии GZMA у пациентов был повышен по сравнению со здоровыми контролями.

Далее исследователи выполнили иммуногистохимический анализ на биопсиях кишечника пациентов с ВЗК различной интенсивности. Окрашивание антителами к гранзиму А привело к значительно более яркой флуоресценции в воспаленных областях по сравнению с участками ткани с низким уровнем воспаления.

Гранзимы экспрессируются в первую очередь T-клетками и NK-клетками, низкие уровни экспрессии отмечали также в нейтрофилах, дендритных клетках и макрофагах. Авторы показали, что при ВЗК гранзим А экспрессируется в основном T-клетками (CD3+), а точнее — цитотоксическими CD8+ T-клетками.

Исследователи выделили CD8+ T-клетки из мононуклеарных клеток периферической крови человека, стимулировали их и измерили уровни гранзима А на разных промежутках времени. Иммуноферментный анализ подтвердил, что уровни внеклеточного гранзима А повышались после культивирования CD8+ T-клеток в течение двух дней в присутствии интерлейкина 2 (ИЛ-2). При культивировании моноцитов в присутствии рекомбинантного человеческого гранзима А в супернатанте возрастало в основном количество ИЛ-8. Тот же эффект наблюдался под действием супернатанта CD8+ T-клеток, стимулированных ИЛ-2.

ИЛ-8 — мощный хемоаттрактант для нейтрофилов, а для ВЗК как раз характерен рост числа нейтрофилов, что и подтвердили исследователи. Вероятно, внеклеточный гранзим А распознается рецептором PAR1.

Авторы синтезировали GzmA-INH, определили оптимальные концентрации для его работы и подтвердили его эффективность на моноцитах. GzmA-INH не обладал цитотоксическим эффектом для иммунных клеток человека в предложенных концентрациях.

Далее исследователи разработали GzmA-CL для измерения активности гранзима А в образцах пациентов с ВЗК. Реакция между GzmA-CL и гранзимом А проходила за минуты и сопровождалась ярким свечением в видимом спектре. Авторы подтвердили, что хемилюминесценция возникала благодаря протеолитической активности гранзима А. GzmA-CL — селективный репортер даже в присутствии других гранзимов.

Наконец, авторы разработали тест, определяющий активность гранзима А в сложном образце кала пациентов с ВЗК. Одновременное определение активности гранзима А и фекального кальпротектина позволило выявить 140 из 147 (95%) пациентов с ВЗК по сравнению с 91 из 147 (62%) при определении одного кальпротектина.

Таким образом, авторы подтвердили опосредованную Т-клетками секрецию активного внеклеточного гранзима А при воспалении кишечника и подчеркнули целесообразность сочетания маркеров врожденного и адаптивного иммунитета для улучшения выявления и мониторинга пациентов с ВЗК.

Снижение числа регуляторных T-лимфоцитов кишечника предшествует развитию болезни Крона