Ингибиторы MDM2 эффективны даже в условиях гипоксии

Во многих опухолях подавлена экспрессия p53. Этот белок, который часто называют «стражем генома», способен останавливать клеточное деление и инициировать апоптоз, что является одним из барьеров на пути к образованию опухолей. Один из механизмов ингибирования p53 опухолевыми клетками — это активация MDM2, белка, который приводит к деградации p53. Именно поэтому существует много препаратов, который нацелены на ингибирование MDM2, что приводит к увеличению экспрессии p53. Однако ранее было показано, что гипоксия в опухолевых клетках может вызывать резистентность к химиотерапии. В новой работе исследователи из Швеции и Чехии оценили, может ли гипоксия сделать раковые клетки нечувствительными к двум ингибиторам MDM2 — нутлину-3а и навтемадлину.

Сначала авторы воссоздали условия нормоксии (21% кислорода) и гипоксии (1% кислорода) для нескольких клеточных линий и подвергли их действию нутлина-3а и навтемадлина. При нормоксии ингибиторы подавили рост клеток трех раковых клеточных линий максимум на 75%. Схожие результаты были получены при гипоксии. Кроме того, если p53 был инактивирован или мутирован, то ингибиторы не влияли на рост клеток (кроме очень высоких концентраций). Это подтверждает p53-зависимый механизм действия ингибиторов MDM2.

Чтобы определить, является ли снижение роста результатом уменьшения количества пролиферирующих клеток, авторы измерили поглощение 5-этинил-2'-дезоксиуридина (маркера синтеза ДНК) клетками, обработанными ингибиторами MDM2. В опытах на человеческих клетках HCT116 p53^+/+ терапия обоими ингибиторами при нормоксии снижала число клеток в S-фазе на 60%. В условиях гипоксии только лечение навтемадлином значительно снижало количество клеток в S-фазе. Сообщается, что гипоксия сама по себе уменьшает пролиферацию клеток и вызывает остановку клеточного цикла. Тем не менее, она не влияла на пролиферацию клеток HCT116 p53^+/+. Авторы заключают, что обработка клеток HCT116 p53^+/+ ингибиторами MDM2 в условиях гипоксии тормозит пролиферацию через остановку клеточного цикла.

В мышиных клетках B16-F10 p53^+/+, но не B16-F10 p53^-/-, обработка ингибиторами MDM2 при нормоксии также снижала количество клеток в S-фазе более чем на 90%. Одна только гипоксия снижала пролиферацию B16-F10 p53^+/+ на 83%, а B16-F10 p53^-/- — на 75%.

Учитывая, что ингибиторы MDM2 вызывают остановку клеточного цикла через активацию пути р53, авторы измерили уровни мРНК и белка двух нижележащих мишеней р53: MDM2 (негативный регулятор р53) и p21 (маркер остановки клеточного цикла). В клетках HCT116 p53^+/+, обработанных нутлином-3а и навтемадлином, экспрессия генов MDM2 и CDKN1A значительно увеличилась (в девять раз и более) как при нормоксии, так и при гипоксии. В то же время для клеток HCT116 p53^-/- в условиях нормоксии или гипоксии не было обнаружено значительных изменений в экспрессии генов. В клетках B16-F10 p53^+/+, обработанных ингибиторами MDM2, экспрессия Mdm2 увеличилась более чем в три раза при нормоксии и при гипоксии, тогда как для клеток B16-F10 p53^-/- значительных изменений в экспрессии генов обнаружено не было. Эти результаты показывают, что активация транскрипции ингибиторами MDM2 происходит при гипоксии с такой же эффективностью, как и при нормоксии для человеческих и мышиных клеточных линий. Также ингибиторы индуцируют экспрессию p53 и p21 при любых условиях.

Ранние работы показывают, что 3D-модели рака имитируют многие особенности солидных опухолей, включая вариации уровня кислорода, экспрессии генов, метаболизма и профилей ответа на лекарства. Поэтому авторы проверили, могут ли нутлин-3а и навтемадлин снизить рост клеток в опухолевых сфероидах — трехмерных моделях, в которых естественным образом развиваются области гипоксии и некроза при диаметре сфероидов 400–600 мкм из-за градиента диффузии кислорода.

Ученые создали опухолевые сфероиды из клеточных линий с активным p53 и обрабатывали их ингибиторами, когда сфероиды достигали диаметра 500–550 мкм. И нутлин-3а, и навтемадлин подавляли рост сфероидов из человеческих клеточных линий более чем на 75%. Нутлин-3а не замедлял рост сфероидов из мышиных клеток, а навтемадлин подавлял рост на 60%.

Было также показано, что эффект ингибиторов сильно зависел от клеточной линии. Так, почти все сфероиды HCT116 p53^+/+ уменьшились после лечения (оставалась солидная масса размера 450–500 мкм), тогда как сфероиды MCF7 разрушались полностью. Сфероиды B16-F10 p53^+/+, обработанные нутлином-3a и навтемадлином, под микроскопом выглядели неповрежденными, но при пипетировании легко распадались на клеточный дебрис. Как и ожидалось, при обработке ингибиторами не наблюдалось подавления роста у сфероидов с инактивированным p53.

Ингибиторы MDM2 активируют противоопухолевый иммунный ответ