Источником неподавляемой виремии у ВИЧ-инфицированных могут быть провирусы, неспособные к репликации

При использовании антиретровирусной терапии ВИЧ-1 сохраняется в CD4+ T-клетках в виде провирусов, способных к репликации. Провирусы часто содержат дефекты (до 90% встроенных геномов), но при этом все равно могут быть способны к транскрипции и трансляции. Такие провирусы затрудняют определение вирусной нагрузки, способствуют воспалению и активации иммунного ответа, производят эпитопы, которые «отвлекают» иммунитет.

Часто у людей, живущих с ВИЧ, наблюдается остаточная виремия, даже если они принимают антиретровирусную терапию. Обычно вирусной РНК немного (1–3 копии/мл), но у некоторых людей уровни выше — более 20 копий/мл, это называется неподавляемая виремия. У провирусов, вызывающих неподавляемую виремию, ранее находили нарушения в 5’-лидерной области (5’L). Даже небольшие нарушения в этой важной области могут помешать репликации. В новом исследовании авторы статьи в Nature Communications показали, что при остаточной виремии доминируют провирусы с дефектами в 5’L.

Исследователи проанализировали образцы плазмы 32 человек, живущих с ВИЧ. У них была неподавляемая виремия, при этом не было выявлено свидетельств нарушений режима антиретровирусной терапии или резистентности ВИЧ к препаратам. Из образцов выделили РНК, синтезировали кДНК с помощью ВИЧ-1-специфичных праймеров, затем провели вложенную ПЦР. Авторы показали, что неподавляемая виремия обусловлена экспрессией генов ВИЧ-1 и высвобождением вириона из инфицированных клеток, а не продолжающейся репликацией.

Последовательности 5’L содержали нарушения у 28 участников. И у большинства РНК, находящаяся в плазме, состояла в основном именно из таких нарушенных вариантов. У шести человек проанализировали CD4+ T-клетки крови и показали, что содержащиеся в этих клетках провирусы были более разнообразными, чем последовательности в плазме. Они тоже содержали нарушения в 5’L, но реже (1,2% против 98% в плазме).

Среди 91 уникального варианта 5’L 26% содержали делеции, а 30% — точечные мутации в основном донорном сайте сплайсинга. Большая их часть нарушала репликацию. Но при этом транскрипция была по-прежнему возможна.

Авторы разработали новую вариацию цифровой ПЦР для определения состояния 5’L — CLAWS (Capturing 5′ Leader Anomalies Without Sequencing) — и подтвердили ее специфичность, чувствительность и способность различать дефектные и интактные последовательности 5’L. Результаты, полученные методом CLAWS, хорошо соотносились с результатами секвенирования. Это подтвердили на новой когорте из 20 человек с неподавляемой виремией.

Дальнейший анализ показал, что до начала антиретровирусной терапии нарушения в 5’L РНК, находящейся в плазме, встречались редко. А провирусы внутри CD4+ T-клеток содержали мало последовательностей 5’L с нарушениями и после терапии.

Метод CLAWS применили к участнику клинического испытания TITAN. Для проверки эффективности нового препарата антиретровирусную терапию отменяли, но вирус быстро реплицировался. В начале исследования в плазме не было отмечено РНК с интактной последовательностью 5’L, она появлялась во время активной репликации вируса, а после возобновления антиретровирусной терапии составляла 56% всей РНК.

Авторы предполагают, что провирусы с нарушениями в 5’L не уничтожаются иммунитетом, несмотря на активную экспрессию вирусных генов. Они создают пул транскрипционно активных, но не способных к заражению геномов. Этот пул — основной источник неподавляемой виремии.

Генная терапия ВИЧ блокирует связывание вируса с рецептором и проникновение в клетку