Команда Дженнифер Дудны рассказала о CRISPR-системе для редактирования отдельных видов бактерий в сообществе

Команда ученых из Калифорнийского университета во главе с нобелевским лауреатом Дженнифер Дудной разработала метод для сайт-специфического редактирования геномов микроорганизмов определенного вида в составе микробного сообщества. Статья о нем была опубликована на этой неделе в журнале Nature Microbiology.

На первом этапе авторы разработали способ оценки способности отдельных видов в сообществе поглощать и встраивать в геном экзогенную ДНК. Способ, получивший название ET-seq, работает следующим образом. Микробное сообщество подвергают действию транспозона mariner, который вставляется в геном неспецифично. Затем из всего микробного сообщества выделяют тотальную ДНК и секвенируют с помощью двух протоколов. В первом протоколе секвенируются границы вставки транспозона в геном — это позволяет определить сайты вставки и количество вставок в каждом геноме. Во втором протоколе проводится глубокое метагеномное секвенирование, с помощью которого оценивается численность каждого биологического вида в сообществе. Результатом ET-seq являются доли клеток микроорганизма каждого вида, в геном которых встроился транспозон, то есть степень генетической доступности микроорганизмов. Точность метода проверили на искусственном сообществе почвенных микроорганизмов, к которому добавили бактерию Klebsiella michiganensis M5a1 с известной генетической доступностью для mariner.

Таким образом, с помощью ET-seq можно оценить долю бактериальных клеток каждого вида, несущих специфичную вставку. Вставка же может быть доставлена в определенный локус генома с помощью РНК-напрявляемой системы CRISPR-Сas, названной DART (DNA-editing all-in-one RNA-guided CRISPR–Cas transposase). Система представляет собой плазмиду, кодирующую бактериальную CRISPR-ассоциированную транспозазу, гидовую РНК и последовательность, которая выполняет роль вставки. CRISPR-ассоциированная транспозаза состоит из Tn7-подобного транспозона и CRISPR-эффектора (в работе использовались транспозазы Vibrio cholerae и Scytonema hofmanni). Гидовая РНК направляет вставку к гену-мишени, что приводит к его инактивации. Вставки несли уникальные баркоды. Это позволяло отследить их в единичных бактериальных клетках, а значит, оценить эффективность редактирования, с помощью ET-seq.

Комбинацию DART и ET-seq сначала проверили на E. coli. В этом эксперименте выяснилось, что система с CRISPR-ассоциированной транспозазой Vibrio cholerae (VcDART) работает более специфично. Дальнейшая проверка VcDART на искусственном бактериальном сообществе, имитирующем почвенную микробиоту, показала, что метод можно использовать для определения функции генов. Опыты с образцом кишечной микробиоты новорожденного продемонстрировали возможность таргетирования клинически значимых локусов в геноме E. coli.

По мнению авторов, комбинация VcDART и ET-seq упрощает генетический анализ и инженерию микроорганизмов, так как уменьшает необходимость в культивировании отдельных представителей микробного сообщества.