Нобелевская неделя 2020. Дженнифер Дудна: «Ответственное использование технологии CRISPR-Cas9»

«Мы были в необычайном восторге, это была чистая радость открытия, означавшего, что мы полностью поняли, как функционирует бактериальный фермент Cas9». Лекция лауреата Нобелевской премии по химии 2020 года. 08.12.2020.

Изображение:
Скриншот  канала Нобелевского комитета

В начале лекции Дженнифер Дудна выразила благодарность Шведской королевской академии наук, Нобелевскому комитету по химии, своей семье, включая супруга, сына и сестер, друзьям, коллегам, и, конечно, настоящим и бывшим сотрудникам ее лаборатории, о чьих исследованиях и шла речь в лекции.

«Я хочу начать с рассказа о происхождении самих идей о CRISPR, это началось по меньшей мере 20 лет назад с исследований в микробиологических лабораториях. Было показано, что у бактерий может быть адаптивный иммунитет, защищающий от вирусных инфекций, позволяющий приобретать защиту в режиме реального времени и затем защищать клетки от вирусов, используя эту систему записи в геноме».


CRISPR-Cas система адаптивного антивирусного иммунитета

С помощью системы CRISPR-Cas бактерии и археи включают маленькие участки ДНК вирусного происхождения в области своего генома, называемые CRISPR (Сlustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Считывающиеся с этих локусов молекулы РНК затем образуют комплексы с белками Cas (Crispr-associated proteins) и участвуют в распознавании и расщеплении вирусной ДНК, а иногда и РНК. Механизм данного процесса в клетках бактерий-хозяев был исследован с помощью молекулярно-генетических и биоинформатических методов. Когда вирус (бактериофаг) вводит свою ДНК в клетку, ее небольшие кусочки встраиваются в CRISPR-локус между повторами, называемыми спейсерами. Со всего локуса считывается общая РНК, которая затем нарезается на индивидуальные единицы, включающие последовательности вирусного происхождения и последовательности спейсеров. Эти РНК-единицы взаимодействуют со вторым типом РНК — tracrRNA (транс-активирующая crispr РНК). Две РНК вместе связываются белком Cas9 — РНК-направляемым белком, сканирующим клетку на предмет комплементарных к этой РНК ДНК-последовательностей и вносящим двухцепочечные разрезы, приводящие к разрушению вирусной ДНК. Для внесения этих разрезов белку Cas9 необходимы не только комплементарность мишени к СRISPR РНК, но и наличие в мишени рядом короткой последовательности PAM (protospacer adjacent motif). Эта последовательность отсутствует в геноме бактерии, благодаря чему ее CRISPR-локусы остаются нетронутыми нуклеазой Cas.

В ходе эволюции система CRISPR-Cas претерпела значительные изменения в разных таксонах прокариот, но первые исследования были сосредоточены на определенном типе — системах, использующих белок Cas9.

В работе CRISPR-иммунитета можно выделить три стадии: адаптацию (встройку последовательностей вирусов в геном), экспрессию (синтез РНК с локусов CRISPR) и интерференцию (распознавание и разрезание белком Cas9). Лаборатория профессора Дудны, включавшая тогда ее бывших студентов Блэйка Виденхефта, Рейчел Хорвиц и других, сосредоточилась на изучении стадии интерференции. В 2011 году лаборатории представился шанс для коллаборации с Эмманюэль Шарпантье и ее студентом Кшиштофом Хилиньски, что позволило ответить на очень волнующий тогда всех вопрос: какова же функция белка Cas9? «Мы были поглощены этим вопросом, потому что конкретно этот белок был вовлечен в защиту клеток бактерий, в частности, тех, которые изучала группа Эмманюэль, — Streptococcus pyogenes, который инфицировал людей. Но каким образом?»

При поиске ответа группа Дудны в коллаборации с Шарпантье использовали биохимические подходы, включавшие в себя очистку белка Cas9 и тех РНК, которые направляли его к ДНК-мишеням. Бывший постдок Дудны Мартин Йенек вместе с Кшиштофом Хилиньски обнаружили, что в природе белок Cas9 направляется сразу двумя РНК: CRISPR РНК, комплементарной уничтожаемой мишени, и tracrRNA, которая, взаимодействуя с первой, способствует сборке РНК-белкового комплекса Cas9.

Ключевая модификация в системе CRISPR для прикладных задач

«Я думаю, одним из замечательных аспектов нашего проекта было то, что он был той точкой в исследовании, когда оно превратилось из просто направляемого любопытством в проект с более широкими возможностями для применения. Как только мы поняли, как в природе используется система из двух РНК для направления Cas9 к последовательностям ДНК, стало возможно сконструировать эту двойную направляющую в составе единственной молекулы гидовой РНК, включающей в себя информацию о мишени и структурный компонент для сборки Cas9». Йенек и Хилиньски выяснили, что такая объединенная гидовая РНК достаточна для разрезания мишени рядом с сайтами PAM.

Ключевой эксперимент Йенека заключался в следующем. Были созданы 5 гидовых РНК, которые узнавали несколько различных участков плазмидной ДНК. Их инкубировали в пробирке вместе с очищенным белком Cas9, а полученные фрагменты ДНК разделили с помощью электрофореза. В зависимости от положения сайта узнавания гидовой РНК относительно сайта рестрикции в плазмиде, размеры ДНК варьировали после расщепления, а следовательно, гидовые РНК работали! «Я хочу сказать, что в день, когда Мартин Йенек сделал этот эксперимент и получил эти результаты, мы были в необычайном восторге, это была чистая радость открытия, означавшего, что мы полностью поняли, как функционирует бактериальный фермент Cas9 и как его можно проектировать». Теперь стало возможно программировать ДНК-расщепляющую способность Cas9, причем не только в бактериях, но и в эукариотических клетках — животных, растений, человека.

CRISPR в клетках эукариот

В клетках эукариот присутствует отличная от бактерий система репарации двухцепочечных разрывов ДНК. В одном случае происходит просто негомологичное соединение двух концов, а в другом — в место разрыва может интегрироваться новый фрагмент ДНК, у которого есть гомология с последовательностями по краям двухцепочечного разрыва. Эти механизмы начали подробно изучаться еще за 20 лет до работы Дудны и Шарпантье. Последние поняли, что введение Cas9 в эукариотическое ядро и последующий двухцепочечный разрыв запустят как раз один из этих механизмов репарации. Введенный в ядро, Cas9 сканирует геном на предмет 20-нуклеотидной последовательности, комплементарной его гидовой РНК. В этом участке Cas9 расплетает двойную спираль, надрезает каждую цепь, а затем эти концы занимают эукариотические ферменты репарации, с помощью которых можно внести изменение в последовательность генома. Как теперь понятно, у эукариот Cas9 эффективно стимулирует оба пути репарации.

Структура комплекса Cas9 открыла механизм разрезания

По какому же механизму Cas9 вызывает двухцепочечный разрыв? Для того, чтобы это узнать, несколько лабораторий, включая лабораторию Дудны, определили кристаллографическую структуру Cas9 в комплексе с гидовой РНК и ДНК-мишенью. Выяснилось, что при связывании Cas9 с мишенью гидовая РНК формирует двойную спираль с одной из цепей ДНК, что способствует точному позиционированию ДНК-мишени в активном центре фермента. При дальнейшем изучении механизма разрезания в серии химических экспериментов лаборатория Дудны показала, что белок Cas9 имеет очень динамичную структуру. «Чтобы иметь возможность обращаться с ДНК, расплетать спираль тем способом, который мы знаем, он должен иметь подвижность». При связывании гидовой РНК один из доменов белка Cas9 разворачивается. Когда Cas9 встречает целевую последовательность ДНК, происходит второе конформационное изменение, позволяющее белку окружить ДНК. Затем домен в активном центре поворачивается, чтобы осуществить разрезание. Эти конформационные изменения позволяют белку, во-первых, «почувствовать» момент узнавания цели, а во-вторых, повысить точность разрезания. Полная подробная структура комплекса Cas9 была получена Фуго Джаном, ныне покойным постдоком Дудны. На трехмерной компьютерной модели видно расположение раскрытой двойной цепи ДНК относительно доменов белка и гидовой РНК, а также вращение домена, разрезающего ДНК.

Динамичность структуры Cas9 проявляется при взаимодействии с длинными участками ДНК, такими как хромосомы эукариот. Ученым из группы Дудны показалась необычной его способность быстро «сканировать» цепь ДНК. Согласно разработанной ими модели, Cas9 может связывать ДНК и диссоциировать от нее очень быстро, пока не найдет последовательность PAM. Возле нее происходит локальное расплетание цепей и проверка комплементарности с гидовой РНК. Когда комплементарный участок найден, расплетенный участок расширяется и происходит разрезание.

Применение технологии: большие возможности и нерешенные вопросы

«Генное редактирование охватывает всю биологию, может использоваться в фундаментальных исследованиях, но также имеет потрясающее применение в здравоохранении, сельском хозяйстве, биомедицине. На мой взгляд, очень важно отметить, что редактирование генома можно провести во многих типах клеток, но по существу таких типов два. Первая категория — соматические клетки, полностью дифференцированные, не имеющие возможность создать новый организм. Напротив, зародышевые клетки — сперматозоиды, яйцеклетки, клетки раннего эмбриона — плюрипотентны и могут дифференцироваться во множество различных типов клеток по мере формирования организма». Таким образом, исследователи могут выбирать, вносить ли изменения в соматические клетки определенной ткани, и тогда эти изменения не будут унаследованы следующими поколениями, либо в зародышевые, и тогда изменения унаследует потомство.

Технология CRISPR может применяться для создания новых сортов культурных растений или новых животных моделей заболеваний человека, но все становится совсем иначе, когда речь идет о биологии человека и манипуляциях с его зародышевыми клетками. «Это стало очень существенной частью моей собственной работы в последние несколько лет — задумываться об ответственном использовании технологии CRISPR-Cas9, и особенно ее использовании на человеке, обеспечении открытости и тщательного продумывания экспериментов с зародышевыми клетками человека. Однако в редактировании соматических клеток, на мой взгляд, есть множество необычных и замечательных возможностей, которые еще разовьются в ближайшем будущем». Одно из таких направлений — коррекция мутаций, вызывающих заболевания. Уже реализованный на пациентах пример — редактирование предшественников эритроцитов у больных серповидноклеточной анемией. «Что касается редактирования зародышевых клеток, следует еще подумать, как эта технология разовьется в будущем. Конечно, я представляю, как мы увидим растущее применение технологии в зародышевых клетках, включая человека, и конечно, с этим нужно обращаться очень осторожно. Я рада, что сейчас есть активные попытки контролировать использование технологии на международном уровне». В недавно вышедшем сборнике установлены этические критерии использования технологии CRISPR на зародышевых клетках человека.

Будущее в изучении CRISPR: поиск новых систем в природе

Одна из удивительных черт CRISPR — это их неописуемое разнообразие в природе. «Это разнообразие продолжает развивать нашу область с точки зрения фундаментальной биологии, позволяя понять, что эти системы делают в естественных условиях у микроорганизмов, и конечно с точки зрения того, как они могут использоваться в технологиях на других организмах».

Среди последних важных находок Дудны совместно с Джиллиан Бэнфилд из Беркли — открытие системы CRISPR-CasΦ в бактериофагах. Нуклеаза в этой системе маленькая и кодируется меньшим по длине геном, чем Cas9. Кроме того, в ней отсутствует tracrRNA, что может быть преимуществом в некоторых практических случаях. Например, это может упростить доставку в клетки.

Также группа изучает разнообразие ферментативных активностей белков Cas. Так, открыли фермент Cas13, который разрезает РНК, а не ДНК. Это свойство можно использовать в диагностике: РНК разрезается на небольшие участки, к которым пришиваются флуорофоры. Флуоресцентный сигнал детектируется при разрезании этих РНК. Данный способ анализа показал высокую чувствительность, специфичность и скорость. В другом исследовании обнаружили белок Cas12, который способен разрезать одноцепочечные молекулы ДНК после распознавания двухцепочечной мишени. На основании этого белка ученые создали тест-систему на папилломавирус человека: его геном состоит из двухцепочечной ДНК, а входящий в набор флуоресцентный зонд — из одноцепочечной, его разрезание и флуоресценция происходят только при наличии ДНК вируса в образце. Система может не просто детектировать вирус, но и специфично различать несколько его типов.

Конечно, создатели CRISPR-систем не могли обойти стороной текущую пандемию. Белок Cas13 может использоваться для быстрой детекции РНК SARS-CoV-2 в слюне или мазках из носоглотки, причем считывающее устройство привязано к мобильному телефону и должно позволить людям осуществлять диагностику самостоятельно.

В заключение Дженнифер Дудна подчеркнула, что механизм функционирования CRISPR-Cas настолько могущественный, что он одинаково работает как для бактерий в природе, так и для эукариот при генно-инженерных манипуляциях. В будущем следует улучшать системы доставки CRISPR-Cas в клетки, а также контроль над вносимыми изменениями. Фундаментальные исследования на прокариотах продолжат приносить новые открытия, а возможности для практического применения безграничны.

В конце лекции Дудна еще раз поблагодарила всех своих коллег, в особенности Эмманюэль Шарпантье, Мартина Йинека и Кшиштофа Хилиньски, всех сотрудников лаборатории и членов семьи.

Посмотреть на PCR.news Нобелевскую лекцию Эмманюэль Шарпантье

Добавить в избранное

Вам будет интересно