Нобелевская неделя 2020. Эмманюэль Шарпантье: «Сейчас прекрасное время для изучения эволюции и биоразнообразия мира»

Нобелевская премия по химии присуждена Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудне «за разработку метода редактирования генома» — знаменитой системы CRISPR-Cas. По словам Шарпантье, она бы предпочла выступить с лекцией «вживую», но обстоятельства вынудили ее сделать запись, которая и была опубликована 8 декабря.

«Многие годы биологов интересовали генетические механизмы, при помощи которых можно исследовать гены. Точные инструменты для распознавания сайтов в геномах и их редактирования для изменения генов и их экспрессии были нужны всегда. Именно это и делает технология CRISPR-Сas. Она, с одной стороны, очень тонкая, а с другой – гибкая и надежная», — говорит Эмманюэль Шарпантье.

Система состоит из белка Cas9, способного разрезать ДНК, и направляющей этот белок РНК, которая задает сайт разрезания. Но что именно делает эту технологию прорывной?

За последние 50 лет было разработано множество технологий для работы с геномом, основанных на исследованиях бактерий и вирусов. Эти технологии позволили секвенировать, амплифицировать, клонировать и рекомбинировать ДНК. В последние 20 лет появились методы точного редактирования генома, такие как TALEN и нуклеазы с «цинковым пальцем». Но систему CRISPR-Cas можно использовать для работы с организмами, которые не поддавались прежним методам редактирования.

История CRISPR-Cas началась с исследований бактерии Streptococcus pyogenes, опасного патогена человека. В то время росло количество научных работ про разнообразные малые РНК. В отличие от хорошо известных матричных, транспортных и рибосомных РНК, эта группа молекул включает в себя множество РНК с широким разнообразием малоизученных функцияй. Некоторые из них участвуют в регуляции экспрессии генов. Именно к этой категории группа Шарпантье изначально причислила tracrРНК — одну из малых РНК бактерии, которую они изучали. Но все оказалось не так просто.

Параллельно ее группа исследовала систему CRISPR. По сути, это иммунная система бактерий и архей, защищающая их от чужеродной ДНК, в основном вирусной. Ферменты рестрикции и модификации ДНК, которые с самого начала молекулярной биологии применялись для манипуляций с ДНК, тоже исходно были частью защитной системы прокариот. Отличие CRISPR-Cas9-системы в том, что она адаптивна — способна «запоминать» и распознавать чужеродную ДНК и вырабатывать специфический иммунитет против нее.

«Я не могу слишком сильно углубляться в историю исследований CRISPR-Cas, но хочу подчеркнуть, что это был труд многих ученых, работавших на переднем крае научного знания, — сказала Эмманюэль Шарпантье. — Когда я начинала работать над CRISPR-Cas, я прочитала все статьи по этой теме, и это позволило мне понять все тонкости, отличающие CRISPR-Cas9 от других CRISPR-Cas-систем».

Локус CRISPR состоит из нескольких коротких повторяющихся фрагментов, между которыми находятся участки, изначально изъятые из чужеродной ДНК. При транскрипции этого локуса образуется длинная молекула РНК (пре-crРНК), затем она расщепляется на малые CRISPR-РНК (crРНК), каждая из которых содержит участок генома одного вируса или фага. Неподалеку от локуса CRISPR располагаются гены, кодирующие Cas-белки. Ученые быстро заметили, что эти белки содержат домены, аналогичные доменам других белков, которые могут распознавать и разрезать ДНК и РНК. Логично было предположить, что Cas имеет такую же способность.

Таким образом, стало понятно, что вся эта машинерия призвана защищать бактерию от чужой ДНК и РНК. Система адаптивна: фрагмент вирусной ДНК встраивается в локус CRISPR, в результате бактерия «запоминает» эту последовательность, которая затем транскрибируется и процессируется, а полученная РНК наводит комплекс Cas-белков на комплементарную ей чужеродную ДНК. После этого один из Cas-белков разрезает вирусную ДНК, делая ее дальнейшую репликацию невозможной.

Группа Шарпантье нашла примечательный вариант системы CRISPR-Cas в бактерии Streptococcus pyogenes. Ее особенность заключается в том, что для работы ей нужен лишь один Cas-белок — Cas9. Но как он направляется на цель? Оказалось, что для этого нужны две РНК. Первая — crРНК, а вторая — та самая tracrРНК, которую открыла группа Шарпантье. TracrРНК необходима для превращения пре-crРНК в активную форму, но дело не только в этом: без нее не произойдет разрезания мишени. Одним своим концом crРНК связывается с tracrРНК, другим — с целевой последовательностью в ДНК, а tracrРНК, в свою очередь, нужна для взаимодействия с Cas9. Фермент в комплексе с двумя РНК наводится на целевую последовательность и режет ДНК неподалеку от нее.

«Мы сразу заметили, что система из Streptococcus pyogenes работала очень эффективно: она делала разрезы именно там, где мы и ожидали, — говорит Эмманюэль Шарпантье. — Стало понятно, что эту систему можно упростить, заменив дуплекс на одну РНК, и программировать ее, изменяя эту РНК. Возможность программировать место разрезания ДНК позволяет использовать эту технологию для того, чтобы исправлять или вносить мутации, удалять гены или иные последовательности, вставлять новые последовательности или заменять одни гены другими. За последние восемь лет ученые и разработчики значительно усовершенствовали технологию — ее современные варианты позволяют совершать точные манипуляции с невероятной скоростью».

CRISPR-Cas-системы в природе постоянно эволюционируют, и на сегодня их разнообразие, по выражению профессора Шарпантье, «восхитительно». На данный момент они делятся на два класса, в каждом из которых есть несколько типов и подтипов. Многие из них, как и CRISPR-Cas9, стали основой для технологий геномного редактирования. Таким образом, CRISPR-Cas дал ученым множество инструментов, и их число продолжает расти.

Эти инструменты принесли огромную пользу фундаментальной науке: с их помощью ученые произвели переворот в генетических исследованиях растений и животных. Не меньший интерес вызывает CRISPR-Cas и в медицинском сообществе. Ожидается, что точное геномное редактирование позволит побороть многие наследственные заболевания, а иммунотерапия, дополненная редактированием геномов иммунных клеток, уже сейчас помогает лечить некоторые виды рака. Животноводство и сельское хозяйство тоже выиграют от развития CRISPR/Cas: используемая с соответствующей осторожностью, эта технология позволит создавать новые сорта сельскохозяйственных культур.

«Что дальше? Исследования CRISPR-Cas не останавливаются. Ученые продолжают искать новые варианты системы в недавно отсеквенированных геномах бактерий и архей. Открытия происходят одно за другим, так что мы можем быть уверены в том, что микробиологические исследования будут и дальше давать нам новые способы манипулирования геномом. Исследования CRISPR/Cas воодушевляют молодых ученых, ведь теперь у них есть мощный инструмент для исследования клеток и организмов, позволяющий проводить исследования, ранее невозможные. И что еще важно, влияние CRISPR/Cas неразрывно связано с другими прорывами в биотехнологиях, такими как высокопроизводительное секвенирование и высокопроизводительный скрининг, новые способы визуализации, новые векторы доставки систем типа CRISPR-Cas в целевые клетки и новые способы поимки микроорганизмов, позволившие изучить ранее неизвестные виды и штаммы. Наука продвигается по всем направлениям. И поэтому я считаю, что сейчас прекрасное время для изучения эволюции и биоразнообразия мира».

Система CRISPR/Cas была открыта в результате микробиологических исследований. Прикладной целью изучения бактерий и вирусов обычно считается противодействие заболеваниям. Но последние 50 лет показали, что для исследования микроорганизмов существует еще одна причина — у них есть необычные особенности, которые могут стать основой новых биотехнологий.

Профессор Шарпантье поблагодарила всех своих коллег, особенно молодых, за их энтузиазм и упорство. Многие ученые удостоились отдельных благодарностей, в том числе Дженнифер Дудна. Шарпантье назвала время, которое она посвятила науке, восхитительным и полным прекрасных коллабораций. В завершение своей лекции она поблагодарила семью, друзей, всех, кто помогал ей в работе и карьере, а также слушателей.