Компьютерный дизайн помог создать белковые антидоты к змеиному яду

Противозмеиные сыворотки, применяемые при укусах ядовитых змей, дороги, малодоступны в бедных регионах и иммуногенны. Исследователи из Великобритании и США под руководством нобелевского лауреата Дэвида Бейкера с помощью глубокого обучения разработали белки-антидоты к трехпальцевым токсинам аспидовых змей. Два из них — антидоты к нейротоксинам — защитили подопытных мышей от смертельного воздействия яда кобры.

Изображение:
Красная плюющаяся кобра на фоне модели ее основного токсина (оранжевый) и антидота к нему.
Credit:
Kate Zvorykina/Ella Maru Studio | пресс-релиз
Укусы ядовитых змей ежегодно уносят более ста тысяч жизней и приводят к тяжелым последствиям для здоровья еще большего числа людей. Таргетных антидотов, которые блокировали бы механизм действия яда напрямую, пока не существует. Обычно в качестве противоядия используют сыворотку иммунизированных животных, содержащую поликлональные антитела. Однако такой антидот не только дорог в производстве и малодоступен в бедных регионах, но и вызывает опасную иммунную реакцию. Альтернативные противоядия — моноклональные антитела или белки, но для их разработки требуется проводить трудоемкий скрининг. Группа ученых из Великобритании и США под руководством нобелевского лауреата Дэвида Бейкера сконструировала несколько новых белков, которые нейтрализуют трехпальцевые токсины змей.

Особенность подхода состоит в том, что эти белки разработаны de novo с помощью метода глубокого обучения RFdiffusion. Эта технология искусственного интеллекта, вдохновленная созданием изображений, сначала генерирует случайный набор аминокислотных остатков, а затем с каждой итерацией уменьшает количество «шума». В конце концов программа выдает структуру белка с нужными свойствами и функциями. Преимущество такой технологии — возможность сконструировать белки с высокой специфичностью и аффинностью к мишени, не прибегая к масштабному скринингу. Как правило, сгенерированные de novo белки также термостабильны и отличаются небольшим размером, что улучшает их способность проникать в ткани. Разработанные de novo белки можно получать в микробных продуцентах, что сокращает стоимость производства препарата.

Яд змей отличается сложным составом. Основной компонент яда некоторых змей, например, кобры, — трехпальцевые токсины (3FTx). Они делятся на несколько типов: коротко- и длинноцепочечные α-нейротоксины и цитотоксины. Именно к этим мишеням ученые и подобрали нейтрализующие белки.

Для α-нейротоксинов характерна структура из нескольких β-цепей, формирующих три петли, и гидрофобное ядро, стабилизированное дисульфидными мостиками. Коротко- и длинноцепочечные α-нейротоксины отличаются по количеству этих мостиков и по длине общей аминокислотной последовательности, поэтому ученые решили разработать белки, нацеленные отдельно против коротко- и длинноцепочечных α-нейротоксинов. Так как α-нейротоксины связываются с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами, чаще всего противоядия к ним блокируют именно эти рецепторы. Однако коротко- и длинноцепочечные α-нейротоксины могут связываться с ацетилхолиновыми рецепторами разных типов, поэтому исследователи решили блокировать непосредственно сами токсины, стерически мешая им связываться с рецепторами.

С помощью RFdiffusion ученые сгенерировали последовательности белков, нацеленных на консенсусный токсин аспидовых змей (короткоцепочечный α-нейротоксин) и на α-кобратоксин (длинноцепочечный α-нейротоксин). В первом случае они отобрали 44 дизайна для дрожжевого скрининга, по результатам которого выбрали белок SHRT с аффинностью к мишени 0,9 нМ. Во втором случае в результате скрининга 38 дизайнов выбрали белок LNG с аффинностью 1,9 нМ. Оба белка оказались термостабильными (причем LNG выдерживал температуру выше 95℃), а структура синтезированных белков совпадала с предсказанной практически с атомной точностью.

Другой класс трехпальцевых токсинов — цитотоксины — разрушает фосфолипидные мембраны, в которые он встраивается за счет петель β-цепей. Именно их ученые решили заблокировать с помощью белка, чтобы нейтрализовать действие яда. Для скрининга они отобрали 55 дизайнов белка, нацеленного против консенсусного цитотоксина, однако после очистки исследовали всего 18 дизайнов. Наилучшие результаты показал белок SPR с аффинностью 271 нМ, однако исследователи отметили, что его еще предстоит доработать.

Эффективность синтезированных антидотов проверили in vitro и in vivo. Способность SHRT и LNG нейтрализовать α-нейротоксины тестировали на культуре клеток рабдомиосаркомы, которые экспрессируют никотиновые ацетилхолиновые рецепторы. При соотношении токсина к антидоту 1:1 SHRT полностью нейтрализовал нейротоксин, в то время как контрольное нанотело, нацеленное против фосфолипазы A2, не имело никакой эффективности. Аналогичным образом LNG нейтрализовал α-кобратоксин в соотношении 1:1, тогда как контрольное нанотело против α-кобратоксина не было эффективно.

Эффективность SPR проверяли с использованием цельного яда семи видов кобр, который на 70% состоит из цитотоксинов. При соотношении токсин:антидот 1:5 эффективность защиты человеческих кератиноцитов от гибели варьировала от 70 до 90%.

В опытах in vivo консенсусный короткоцепочечный α-нейротоксин (LD50 0,098 мкг/г) и α-кобратоксин (LD50 0,087 мкг/г) инкубировали с соответствующими антидотами и вводили мышам внутрибрюшинно, а затем отслеживали выживаемость животных в течение 24 ч. Выживаемость мышей была стопроцентной как с SHRT, так и с LNG, если токсин и антидот применяли в соотношении 1:10. При этом противоядия не демонстрировали кросс-реактивности к другим ядам.

Исследователи провели и более приближенные к реальности эксперименты, когда мышам сначала вводили яд, а через 15 или 30 минут — противоядие. SHRT обеспечивал 100%-ную защиту на 15-минутном интервале (при этом мышам вводили летальную дозу токсина, то есть утроенную LD50). Через 30 минут SHRT показал аналогичные результаты, а вот LNG обеспечивал 60–80% выживаемости в зависимости от дозировки (соотношение токсина к антидоту 1:5 или 1:10). Негативных последствий от введения только антидота выявлено не было.

Таким образом, дизайн de novo позволил создать белковые антидоты, которые эффективно нейтрализовали все три подсемейства трехпальцевых токсинов и защитили мышей от их смертельного воздействия. Авторы подчеркивают, что подобный подход способен в целом упростить разработку терапевтических препаратов и снизить затраты на их создание, особенно в условиях ограниченных ресурсов.

Антитело широкого спектра действия нейтрализует нейротоксины разных видов змей

Источник

Vázquez Torres, S. et al. De novo designed proteins neutralize lethal snake venom toxins // Nature (2025). DOI: 10.1038/s41586-024-08393-x

Добавить в избранное