Антитело широкого спектра действия нейтрализует нейротоксины разных видов змей

В настоящее время при укусах змей используют противозмеиную сыворотку. Ее получают гипериммунизацией лошадей или овец. Такие сыворотки содержат поликлональные антитела, которые эффективно нейтрализуют яд змей конкретного вида. Однако эти противоядия не всегда безопасны, так как могут содержать примеси, а чужеродные антитела могут вызывать иммунный ответ. Кроме того, они видоспецифичны, а содержание антител в них сильно варьирует от партии к партии. Чтобы решить эту проблему, авторы публикации в Science Translational Medicine разработали антитело широкого спектра, которое действует против токсинов разных видов змей.

Ученые сосредоточились на разработке антитела против нейротоксина 3Ftx (трехпальцевый токсин), который входит в состав яда аспидовых змей. 3Ftx взаимодействует с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами (nAChR) в нейромышечных синапсах, что приводит к параличу или удушью. При этом в зависимости от длины цепочек выделяют разные классы токсинов: 3Ftx-L содержат длинную белковую цепочку, а 3Ftx-S — короткую.

Для разработки антитела авторы сначала подобрали панель из восьми токсинов 3Ftx-L, которые вырабатываются разными аспидами из Азии и Африки. Для всех токсинов была известна структура, все они связывали nAChR человека и демонстрировали известный механизм действия в экспериментах на мышечных клетках.

Далее ученые отобрали антитела, связывающие 3Ftx-L, из библиотеки, содержащей 6*10¹⁰ уникальных Fab-фрагментов, представленных на дрожжевом дисплее. Спустя четыре раунда селекции исследователи отобрали 30 кросс-реактивных антител, а затем сократили выборку до 16 антител, которые не только связывали все варианты токсинов, но и не имели сродства к побочным целям. С помощью поверхностного плазмонного резонанса ученые определили, что афинность всех антител находилась в диапазоне от 1 до 100 нМ для большинства вариантов токсинов. Также они проверили, насколько эффективно все антитела нейтрализуют антагонистическое действие нативного 3Ftx-L — α-бунгаротоксина — против nAChR мышечных клеток. В результате исследователи нашли наилучшего кандидата среди всех антител — LB5_95. Антитело подвергли процедуре созревания аффинности.

В результате ученые получили антитело 95Mat5, которое показало высокую аффинность ко всей панели токсинов и эффективно их нейтрализовало. В дальнейшем они работали с этим антителом. Чтобы оценить спектр его действия, ученые сконструировали дрожжевой дисплей с библиотекой из 828 вариантов 3Ftx, в том числе 149 вариантов 3Ftx-L. Эту библиотеку исследователи отсортировали таким образом, чтобы разделить нефункциональные 3Ftx-L (не связывающие человеческие nAChRα) и «избегающие» связывания с антителом 95Mat5 Антитело 95Mat5 было специфичным к токсинам 3Ftx-L, но не связывалось с другими классами токсинов.

Анализируя библиотеку вариантов 3Ftx-L, ученые выяснили, что антитело могло связывать 66% токсинов 3Ftx-L, остальные 28% не связывались с человеческими рецепторами, а всего 5% «избегали» антитела, но имели сродство к nAChR. Так исследователи показали, что антитело 95Mat5 может связывать нейротоксины, вырабатываемые 38 видами и 16 родами аспидов, обитающих в различных ареалах.

Чтобы подтвердить действие антитела, ученые провели эксперименты на мышах. Они оценивали эффективность нейтрализации очищенного α-бунгаротоксина из яда южнокитайского многополосого крайта. Сначала исследователи определяли полулетальные дозы ядов при подкожном и внутривенном введении, а потом делали внутривенную инъекцию двойной такой дозы мышам. Животным вводили либо чистый α-бунгаротоксин, либо токсин, заранее инкубированный с антителом 95Mat5. Мыши из контрольной группы умирали от отравления в течение четырех часов, но те, которые получали антитело, обычно выживали и не испытывали паралича или других симптомов, свидетельствующих о нейротоксичности.

Далее исследователи проводили аналогичный эксперимент, используя неочищенные яды моноклевой кобры, королевской кобры и черной мамбы, чтобы оценить спектр действия антитела. В качестве положительного контроля они также использовали коммерческие видоспецифичные сыворотки-противоядия. После инъекции яда моноклевой кобры мыши умирали в течение часа, но антитело или противоядие защищали их в течение 24 часов. Антитело также защищало мышей от яда черной мамбы, но требовалась более высокая доза сыворотки-противоядия. Против яда королевской кобры эффективность антитела была снижена (только 20% мышей пережили 24 часа), но это было лучше, чем эквивалентная доза сыворотки. При этом ученые отметили, что мыши были активны первые 12 часов после инъекции, у них не было отмечено симптомов, свидетельствующих о нейротоксичности, то есть, скорее всего, гибель животных наступала от действия других компонентов яда.

Ученые также повторили in vivo эксперименты, лучше отражающие реальные условия, когда мышам сначала вводили яд моноклевой кобры или черной мамбы, а через 10–20 минут после этого — антитело. В контрольной группе мыши погибали в течение трех часов после введения яда, в то время как при введении антитела они выживали в течение 24 часов и не проявляли симптомов нейротоксичности. Так ученые доказали, что одно антитело 95Mat5 имеет достаточно широкий спектр действия, чтобы нейтрализовать действие ядов разных видов змей.

Чтобы объяснить механизм действия антитела, ученые определили кристаллическую структуру Fab-фрагмента антитела 95Mat5 в комплексе с 3Ftxx-L15. Это позволило выяснить, что антитело имитирует связывание токсинов с рецептором nAChRα1.

Ученые отметили, что пока они далеки от разработки универсального противоядия. Антитело 95Mat5 защищает только от токсинов 3Ftx-L, в то время как яд змей содержит и токсины 3Ftx-S, и множество других классов токсинов. Так, в яде аспидовых змей представлены фосфолипазы, а в яде гадюк — металлопротеиназы и сериновые протеазы. Соответственно, универсальное противоядие будет содержать 4–5 антител широкого спектра действия, каждое из которых способно нейтрализовать целый класс токсинов.

Антитела к змеиному яду усиливают его токсичность