Лигандзависимый РНК-переключатель обеспечивает контроль экспрессии генов в клетках млекопитающих

Возможность контролировать экспрессию генов в клетках млекопитающих важна для генной терапии, поскольку оверэкспрессия может вызывать токсические реакции и даже приводить к смерти. Существующие системы регуляции ограничены тем, что, к примеру, введение дополнительных регуляторных белков может вызывать иммунные реакции, а рибопереключатели зачастую оказываются недостаточно эффективны. Чтобы решить эту проблему, исследователи из Медицинского колледжа Бейлора предложили лигандзависимый РНК-переключатель.

Разработанный подход основан на следующем принципе. В 5′ нетранслируемую область (UTR) целевого сгена вводится искусственный сигнал полиаденилирования (PAS), окруженный аптамерной последовательностью. Этот сигнал вызывает расщепление соответствующей мРНК, что, в свою очередь, разрушает кодирующую область и препятствует экспрессии целевого сгена. Низкомолекулярный лиганд, который связывается с последовательностью РНК-аптамера, ингибирует расщепление мРНК и обеспечивает экспрессию.

Для создания РНК-переключателя авторы работы использовали хорошо изученный аптамер cb32, связывающий тетрациклин. В его последовательность они включили искусственный сигнал полиаденилирования AAUAAA, размещая его в разных положениях, чтобы определить, в каком из них сохранится высокая активность сигнала. Эффективность выключения гена проверяли с помощью репортерной люциферазы, встраивая полученные конструкты в 5` UTR ее гена. Оптимальную конфигурацию, содержащую две копии PAS, ученые использовали для дальнейшей работы. Они также внесли в последовательность модификации, улучшающие связывание с тетрациклином, и встроили в концевую петлю еще два аптамера.

Исследователи протестировали несколько вариантов полученной Y-образной структуры и выбрали тот из них, который давал самую высокую индукцию экспрессии гена при добавлении 2 мкM (1 мкг/мл) тетрациклина — в 63 раза. Чтобы добиться еще большей чувствительности, ученые дополнили разработанную систему механизмом альтернативного сплайсинга, который происходит при участии G-квадруплекса и также зависит от низкомолекулярного лиганда.

Из всех испытанных конструктов один (Y395) обеспечивал 925-кратную индукцию экспрессии гена при добавлении 1 мкг/мл тетрациклина. Такой РНК-переключатель авторы работы обозначили как pA-регулятор.

Затем ученые проверили, какой диапазон концентраций тетрациклина обеспечивает эффективную регуляцию экспрессии. Для этого они построили кривые «доза-ответ» для двух конструктов, обозначенных в работе как Y362 и Y387. Выяснилось, что EC₁₀₀ (концентрация, обеспечивающая максимальный ответ) для обоих конструктов составила 2,5 мкг/мл. Такая концентрация обеспечивала 900-кратную и 800-кратную индукцию экспрессии репортерного гена. EC₅₀ — концентрация полумаксимального ответа — равнялась 0,7 мкг/мл для Y362 и 0,5 мкг/мл для Y387. При пероральном приеме тетрациклина взрослым человеком в рекомендованной FDA дозировке (500 мг дважды в сутки) концентрация тетрациклина в плазме крови достигает 5 мкг/мл и затем постепенно снижается до 1–2 мкг/мл. Таким образом, предложенные учеными РНК-переключатели работают в диапазоне концентраций, который обеспечивается приемом одобренных FDA доз препарата.

Исследователи также продемонстрировали, что pA-регулятор совместим с разными промоторами и может использоваться для контроля экспрессии различных генов — для этого они заменили репортерный ген на eGFP и использовали промоторы Ubi, EF1a и PGK.

Наконец, авторы работы проверили эффективность разработанной системы на мышах. Для этого конструкт, содержащий Y387 и ген люциферазы, поместили в аденовирусный вектор, который затем вводили в мышцы задней лапы животных. Затем мышам внутрибрюшинно вводили однократную дозу 30, 50, 60 или 80 мг/кг тетрациклина. До инъекции наблюдалась незначительная экспрессия люциферазы, а введение 80 мг/кг индуцировало сильный люциферазный сигнал. Количественный анализ показал дозозависимый эффект — однократные дозы в 30, 50, 60 и 80 мг/кг приводили к средней индукции в 5, 13, 106 и 207 раз, соответственно.

Кроме того, предложенную систему можно использовать для регуляции экспрессии эндогенных белков. Чтобы подтвердить это, авторы разработки внедрили pA-регулятор в локус CD133 при помощи CRISPR-Cas9. Опыты проводили на клетках HEK293, которые в норме не экспрессируют CD133. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что добавление тетрациклина к клеткам индуцировало его экспрессию, при этом максимальная индукция оказалась 1200-кратной.

Разработанная система значительно превосходит по эффективности существующие подходы к регуляции экспрессии трансгенов. Кроме того, она позволяет регулировать экспрессию эндогенных белков. Авторы рассчитывают, что предложенный подход откроет новые возможности для биологических исследований, а также для клинических применений, таких как генная и клеточная терапия ex vivo и in vivo.

Обратимый РНК-переключатель на основе hammerhead-рибозимов