Обратимый РНК-переключатель на основе hammerhead-рибозимов

Для широкого применения генной терапии необходимы инструменты, позволяющие регулировать экспрессию внедряемых генов. На эту роль претендуют РНК-переключатели. Их основные преимущества — малый размер (не более 200 п. о.) и отсутствие необходимости вводить потенциально иммуногенные белковые компоненты.

Частным случаем РНК-переключателей являются рибозимы типа hammerhead — это класс маленьких автокаталитических быстро действующих рибозимов.

Hammerhead-рибозимы состоят из трех двухцепочечных спиральных участков, разделенных короткими консервативными линкерами. Рибозим типа hammerhead может относиться к одному из трех классов, в зависимости от того, в какой из спиралей (I, II или III) находятся 5’ и 3’-концы рибозимной РНК.

Новое исследование, опубликованное в Nature Biotechnology, посвящено созданию РНК-переключателей на основе рибозимов типа hammerhead III класса. Такие переключатели катализируют разрезание мРНК в цис-положении. Переключатели можно очень точно регулировать с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, блокирующих формирование каталитически активной структуры рибозима.

Механизм работы переключателя на основе hammerhead-рибозима следующий: встроенный в 3’UTR рибозим обеспечивает расщепление мРНК, после чего мРНК, лишенная полиаденильного хвоста, деградирует.

За основу переключателя авторы взяли N107 — hammerhead-рибозим I класса. Для экспериментов на культуре клеток 293Т его встраивали в 3’UTR гена люциферазы и доставляли конструкцию в клетки при помощи аденоассоциированного вируса (AAV). Было показано, что N107 снижает экспрессию репортерного гена в 18 раз.

На основе N107 ученые создали ряд модифицированных рибозимов, относящихся к классу III, — они характеризуются более быстрым и эффективным действием. Самый удачный вариант снижал экспрессию целевого гена в 1200 раз.

Далее авторы сделали выключение гена обратимым, используя морфолиновые олигонуклеотиды. Они протестировали ряд морфолиновых олигомеров против ряда рибозимов и нашли, что наибольший диапазон регуляции экспрессии обеспечивает олигонуклеотид v-M8 при нокдауне гена рибозимом T3H38.

По мнению исследователей, генная терапия может успешно работать в скелетных мышцах: медленное обновление клеток и большое количество сосудов будет способствовать длительной экспрессии и поступлению в кровь терапевтического белка.

Авторы проверили предположение на мышах. В икроножную мышцу мыши вводили вектор AAV1, несущий ген люциферазы с hammerhead-рибозимом в 3’UTR. При введении v-M8 наблюдалась дозозависимая индукция экспрессии люциферазы. Уровень экспрессии можно было многократно поднять более чем в 100 раз на протяжении 43 недель.

Аналогичный опыт авторы провели также с эритропоэтином. В икроножные мышцы мышей ввели вектор AAV1, несущий ген мышиного эритропоэтин с регуляторным рибозимом. Морфолиновый олигомер, введенный через 12 суток, запустил экспрессию гена. Эффект сохранялся в течение приблизительно двух недель, а концентрация эритропоэтина в 100 раз превышала физиологическую норму. Снижая количество вектора и олигонуклеотида, ученые оптимизировали уровень экспрессии белка таким образом, чтобы его продукция поддерживалась на уровне физиологической нормы в течение недели после инъекции.

Новая система переключения активности генетических конструкций, введенных в организм, имеет огромный терапевтический потенциал. Например, авторы предполагают возможность длительной экспрессии белков с коротким периодом жизни или тканеспецифичной продукции антител.