Лимфоциты для терапии опухоли можно получить из крови с помощью магнитных меток

Использование лейкоцитов, инфильтрирующих опухоль (tumour-infiltrating lymphocytes, TIL), для иммунотерапии эффективно при лечении ряда раковых заболеваний. При этом методе терапии лимфоциты отбираются из опухолевых тканей, культивируются in vitro и трансплантируются обратно пациенту. Необходимость рассечения опухоли привела к тому, что пока что терапия с применением TIL показала эффективность только на меланомах, в которых крупные (более 3 см) опухоли легко доступны для операции. Новое исследование, опубликованное в Nature Biomedical Engineering, описало альтернативный подход, позволяющий использовать для адоптивной терапии реагирующие на опухоль лимфоциты, циркулирующие в крови (cTRL).

Для подтверждения присутствия cTRL в крови ученые использовали мышиные модели опухолей, экспрессирующих заранее известные эпитопы (куриный овальбумин (OVA) или гемагглютинин вируса гриппа (HA)). После достижения опухолью размера 300–800 мм³ ученые зафиксировали в крови cTRL, реагирующие на известные эпитопы. Они составляли 0,05–0,45% от всех CD8⁺ T-клеток. Опыты с трансплантацией опухолей между мышами показали, что cTRL обладают свойствами Т-клеток памяти и способны мигрировать между опухолями.

Крайне низкая численность cTRL обуславливает сложность их изоляции — традиционные флуоресцентные методы сортировки клеток не позволяют получить необходимое для культивирования количество клеток. Более того, классические методы предусматривают использование в качестве метки мультимеров MHC, для получения которых необходимо рассечение опухоли. Авторы предположили, что подробное описание фенотипа cTRL позволит выявить универсальных маркер для этого класса клеток.

Исследователи разработали новый метод изоляции клеток. Отобранные из крови мышей из предыдущего эксперимента образцы лимфоцитов обрабатывали мультимерами MHC I, имитирующими известный эпитоп. Флуоресцентная метка, которую несут мультимеры, использовалась в качестве места прикрепления магнитных наночастиц. Далее клетки прогонялись через специальную систему для микрофлюидики, включающую магниты и карманы для захвата клеток. Несущие магнитные частицы cTRL задерживались в системе, в то время как остальные лимфоциты проходили сквозь нее. Ученые достигли чистоты изолированной популяции в 76% для OVA и 84% для HA-опухолей.

Изолированные cTRL использовали для секвенирования Т-клеточного рецептора (TRC) и анализа экспрессии генов через РНК-секвенирование. Авторы показали, что cTRL имеют TRC-фенотип, на 30–85% схожий с TIL (для не-cTRL периферических мононуклеарных клеток совпадение составляет около 10%). РНК-секвенирование показало, что cTRL имеют фенотип активированных, частично истощенных тканевых Т-клеток памяти. Сравнение паттернов экспрессии cTRL от мышей с OVA и HA-опухолями выявило 12 генов, экспрессия которых была повышена в обеих группах. Наиболее значимо была повышена экспрессия гена ITGAE, кодирующего белок CD103. Повышенная экспрессия этого гена в cTRL была подтверждена еще на двух мышиных моделях. CD103 регулирует формирование филоподий и играет критическую роль в процессах клеточной миграции.

Адаптация вышеописанных методов изоляции клеток с CD103 в качестве маркера, а также модификация протоколов культивирования позволили ученым получить популяции cTRL численностью 0,1–4 миллиона клеток из одной мыши. Опыты на мышиных моделях показали, что терапевтический потенциал cTRL при использовании в адоптивной терапии сопоставим с TIL — оба класса клеток повышали медиану выживаемости на 40–50%. Комбинированная терапия с использованием cTRL и анти-PD-1 препаратов повышала эффективность лечения приблизительно в 2 раза по сравнению с только cTRL.

Наконец, авторы изолировали cTRL из образцов крови пациентов. При культивировании с раковыми клетками 51% cTRL экспрессировали IFNγ (маркер активации). В популяции CD103^- Т-клеток экспрессию IFNγ показывали только 8,4%. При этом активация cTRL оказалась специфичной для пациента — клетки показывали значительно более активный ответ на клетки опухоли своего «хозяина». Потенциальная терапевтическая эффективность cTRL поддерживается также метаанализами взаимосвязей уровня экспрессии CD103 с уровнем иммунной инфильтрации опухоли и прогнозом выживаемости.

Таким образом, исследование представило новую технологию для изоляции cTRL и продемонстрировало терапевтический потенциал этих клеток для применения в адоптивной терапии рака. 

Новый подход в сортировке лимфоцитов для адоптивной иммунотерапии