Малая РНК фага «захватывает» механизм репликации бактерии и поддерживает литический путь

Бактериофаг лямбда — умеренный фаг, который заражает Escherichia coli. Его цикл хорошо изучен, но меньше известно о посттранскрипционной регуляции. Важную роль в регуляции экспрессии генов бактерий играют малые РНК. РНК-шаперон Hfq, особенно важный для грамотрицательных бактерий, облегчает эти взаимодействия и влияет на стабильность мишени и (или) трансляцию. Для идентификации пар РНК, связанных с Hfq, используют такие методы, как RIL-seq, CLASH, Hi-GRIL-seq и iRIL-seq. При RIL-seq взаимодействующие РНК сшиваются с белком с помощью УФ, совместно очищаются, а проксимальные концы РНК лигируются для образования химер. Затем секвенирование позволяет идентифицировать отдельные и химерные РНК и выявить взаимодействующие пары.

Сообщалось о случаях регуляции жизненного цикла фага на уровне РНК. Недавние достижения в области секвенирования РНК (RNA-seq) позволили обнаружить потенциальные малые РНК, кодируемые фагами, что говорит о возможности межвидовой регуляции на основе РНК между бактериями и фагами — нового способа бактериально-фаговой коммуникации. Чтобы выявить такие взаимосвязи, исследователи из Израиля и США картировали РНК-РНК взаимодействия и транскриптом бактерий во время заражения фагом.

Исследователи выращивали штамм E. coli MG1655, несущий FLAG-меченый ген Hfq, затем разделили культуры и заразили одну из двух субкультур фагом лямбда дикого типа. Образцы отбирали в два момента времени: через 30 и 60 минут после заражения, после воздействия УФ-излучения для сшивания РНК и белков. Затем были применены протоколы RNA-seq и RIL-seq.

Уровни экспрессии многих малых РНК и мРНК E. coli, ранее не связанных с фаговой инфекцией, возрастали после заражения. Так, уровень cpxQ увеличился примерно в 2 раза в оба момента времени. Эта малая РНК модулирует реакцию внутренней мембраны на стресс, что указывает на потенциальную защитную роль. Уровень экспрессии его гена-партнер cpxP возрастал примерно в 3 раза за 60 минут. CpxP является частью системы устойчивости к экстрацитоплазматическим стрессам. Другой транскрипт, уровень которого вырос, — это rdgC. Более высокие уровни rdgC могут способствовать лизогении.

Анализ фрагментов RIL-seq позволил получить два набора данных: одиночные фрагменты, в которых оба чтения картированы в одной и той же области генома, и химерные фрагменты, в которых парные чтения картированы в разных областях внутри или между геномами (например, E. coli и лямбда). Воспроизводимость результатов была высокой.

Сравнение инфицированных и неинфицированных культур методом RIL-seq показало, что лямбда-инфекция существенно изменяет взаимодействие между малыми РНК и РНК E. coli. Интересно, что в оба момента времени появлялись многочисленные пары РНК лямбда-лямбда и E. coli-лямбда. Ключевую роль во взаимодействиях в условиях инфекции играл белок CpxQ, который также был обнаружен в химерах с РНК, кодируемыми фагом лямбда.

В наборе данных о взаимодействии РНК-РНК доминировали две РНК. Одной из них была мРНК CpxQ E. coli, а другая картировалась в области раннего оперона лямбда. Предположительно, эта область кодирует малую РНК — PreS. PreS часто образует химеры на Hfq, что подчеркивает ее потенциальную роль в регуляции процесса заражения.

Действительно, фаг кодирует малую РНК PreS, а также еще две малые РНК LPR2 и lambda-6S. PreS экспрессируется преимущественно во время литического цикла. По данным RIL-seq, у PreS десятки мишеней, в основном кодируемых E. coli, тогда как LPR2 и lambda-6S РНК имеют меньшие наборы мишеней, включая как РНК, кодируемые фагом лямбда, так и РНК, кодируемые E. coli.

PreS имеет размер примерно 88 нуклеотидов и образуется в результате процессинга длинного транскрипта. Биогенез PreS зависит от РНКаз хозяина. Уровень PreS был значительно снижен в отсутствие Hfq, что указывает на то, что Hfq способствует ее созреванию или стабильности. Дальнейший анализ показал, что PreS участвует в контроле спонтанного перехода фага от лизогенного к литическому циклу. Эта малая РНК способствует репликации ДНК, вероятно, посредством прямой активации dnaA, dnaN или их обоих. Белок PreS был консервативен (идентичность ≥92%) у лямбдоидных и других фагов, а также в различных бактериальных геномах, вероятно, как часть профагов.

Авторы пришли к выводу, что PreS поддерживает литический цикл фага лямбда путем увеличения экспрессии dnaN, тем самым усиливая репликацию фагового генома. Они предлагают следующую модель. PreS вырабатывается либо при проникновении фага в бактерию, либо после вырезания профага, что происходит спонтанно или в результате стресса. В обоих сценариях начинается транскрипция фаговых РНК, в том числе PreS, биогенез которых зависит от РНКаз хозяина. PreS взаимодействует с Hfq и регулирует множество транскриптов E. coli либо положительно (например, dnaN), либо отрицательно (например, alaS). Эта регуляторная активность поддерживает репликацию ДНК фага и способствует литическому развитию.

Холерный вибрион против бактериофага: битва малых РНК