«Мамонтомышь»: до мамонта еще далеко

Американская биотехнологическая компания Colossal Bioscience известна своими амбициозными проектами по оживлению (de-extinction) мамонтов, тасманийских тигров и дронтов. Компанию основали в 2021 году известный генетик и молекулярный биолог Джордж Черч совместно с предпринимателем Беном Ламмом, который  обещал к 2028 году получить мамонтенка, генетически модифицировав азиатского слона. Четвертого марта Colossal Bioscience сообщила о получении шерстистых мышей, которых генетически модифицировали таким образом, чтобы изменить фенотип шерсти и особенности липидного обмена. Результаты исследования опубликованы в виде препринта на bioRxiv. Среди соавторов, помимо Черча, Ламма и директора по науке Colossal Бет Шапиро, — Лав Дален и другие исследователи геномов мамонтов.

Одна из проблем экспериментов по генетическому редактированию слонов (помимо очевидных трудностей с содержанием животных) связана с их потенциальной продолжительностью. Беременность слонов длится 22 месяца, а методы получения генномодифицированных организмов на них не отработаны. Использование слонов в качестве моделей также сопряжено с этическими проблемами: это животные с развитыми когнитивными способностями, кроме того, все три ныне существующих вида слонов находятся под угрозой исчезновения. Мышей ученые рассматривают как удобную альтернативу слонам: на мышах можно отработать протоколы внесения мутаций в большое количество генов и оценить влияние этих мутаций.

В текущей серии экспериментов исследователи намерены обнаружить, как генетические изменения обуславливают приспособления мамонтов к холоду (шерстистость, особенности липидного обмена и т. д.). Для получении «шерстистого» фенотипа исследователи вносили мутации с потерей функции (loss-of-function) в семь генов: Tgm3 (loss-of-function мутации в этом случае приводят к вьющейся шерсти и вибриссам), Fzd6 (регулирует ориентацию волосяных фолликулов), Astn2 (делеция экзона 5 совместно с потерей Fzd6 поднимает волоски «дыбом» — угол между направлением роста волоса и кожей увеличивается), Fam83g (отвечает за текстуру шерсти), Fgf5 (регулирует длину волосков), Tgfa (loss-of-function мутации также приводят к вьющейся шерсти) и Mc1r (влияет на окраску шерсти). Чтобы добиться нужной текстуры шерсти и сделать ее вьющейся, ученые также вводили точечные мутации в гены кератина, Krt25 и Krt27. Модификацией шерсти мышей ученые не ограничились и нокаутировали ген Fabp2, который участвует в транспорте жирных кислот.

Большинство этих мутаций у мышей уже были описаны в литературе. Из всех внесенных мутаций только три характерны для мамонтов: нокаут Fabp2, Tgfa и точечная мутация в Krt27.

Чтобы получить шерстистых мышей, исследователи использовали три разных метода: напрямую редактировали зиготы комплексом CRISPR-Cas9 или редакторами оснований, а также получали химер, редактируя CRISPR-Cas9 мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК).

С помощью прямого внесения рибонуклеопротеина Cas9 и гидовой РНК в зиготы мышей ученые нокаутировали шесть генов: Fgf5, Mc1r, Fam83g, Fzd6, Tgm3, Fabp2. Затем зиготы дорастили до стадии бластоцисты с эффективностью 56%. Двадцать восемь из 42 полученных бластоцист были подсажены мышам, в результате родилось 8 мышат (эффективность на этапе рождаемости — 29%). Средняя эффективность генного редактирования составила 92%, при этом практически не наблюдалось мозаичности и нецелевого редактирования (всего 11 нецелевых изменений из 282 возможных, которые не привели к миссенс-мутациям). В результате получились мыши с длинной вьющейся шерстью кремового цвета, текстура волосков тоже изменилась.

Используя редакторы цитозина, исследователи нокаутировали семь генов: Fgf5, Mc1r, Fam83g, Fzd6, Tmg3, Astn2, Fabp2. Редакторы цитозина вместе с гидовой РНК также вводили в зиготы, 70% которых развились в бластоцисту. При этом родилось всего 5 мышат (эффективность 11%). Средняя эффективность редактирования составила 73%, при этом у каждой мыши хотя бы в одном локусе образовывалась гетерозигота, а не гомозигота. Шерсть у полученных мышей тоже отличалась по текстуре от дикого типа и была более вьющейся, но из-за сниженной эффективности редактирования гена Mc1r получилось больше животных окраски агути, а не кремовой.

Третий метод представлял собой получение химер. В мышиные ЭСК с помощью CRISPR-Cas9 вносили нокауты Tgfa, Fgf5, Mc1r и точечные мутации в Krt25 и Krt27. Наиболее эффективно отредактированные ЭСК вводили в эмбрионы на стадии восьми клеток; 99% этих эмбрионов дошли до стадии бластоцисты. В итоге из 90 эмбрионов, которым ввели ЭСК, родилось семь мышей (эффективность 8%). У таких мышей тоже была кремовая длинная шерсть с особой грубой текстурой.

Исследователи отметили, что любой из предложенных ими способов можно использовать для успешного получения генномодифицированных мышей, у которых отредактировано несколько генов сразу. Данных о том, действительно ли шерстистые мыши стали более устойчивыми к холоду, они не предоставили. Влияние нокаута Fabp2 на липидный обмен животных также не было описано, однако исследователи отметили, что средняя масса тела шерстистых мышей не отличалась от массы мышей дикого типа.

Научное сообщество отнеслось к новости о создании «мамонтомышей» с некоторым скепсисом. Прежде всего, как уже говорилось, из 10 мутаций, которые использовались в исследовании, всего три на самом деле были характерны для мамонтов. Следовательно, в итоге получились просто мыши с особым внешним видом шерсти, который мало общего имеет с волосяным покровом мамонта.

Одновременное введение большой панели «мышиных» и «мамонтовых» мутаций не позволяет оценить вклад в фенотип именно мутаций, которые характерны для мамонтов. Винсент Линч, эволюционный генетик из Университета Буффало (США), в комментарии журналу Nature отметил: «Было бы здорово, если бы исследование показало, есть ли у мутаций, специфичных для мамонта и выявленных в результате сравнения геномов животных, реальные последствия для фенотипа, но это не было сделано».

Результаты прокомментировал также Стефан Ризенберг, специалист в области геномного редактирования из Института эволюционной антропологии Макса Планка (Германия). Его лаборатория вводила мутации, характерные для неандертальцев, в стволовые клетки человека современного типа, чтобы лучше понять генетические основы эволюции человека. «Однако невозможно воссоздать неандертальца, и не стоит этого делать», — заявил он. (Colossal Genetics ставит своей целью воссоздать мамонтов, чтобы заполнить опустевшие после них экологические ниши.) «До получения мамонта или «мамонтомыши» еще далеко. Получилась просто мышь с некоторыми особыми генами», — говорит Стефан Ризенберг.

Мамонт, возможно, отрастил шерсть из-за обширной делеции в гене DROSHA