МД-2021, день 1. Молекулярная диагностика в онкологии

Секцию открыл Пьер-Жан Лэми из Страсбургского университетского госпиталя (Франция) с докладом «От NGS (высокопроизводительного секвенирования нового поколения) до масс-спектрометрии для молекулярного анализа рака легких». Он представил Центр IMAGENOME, который проводит генетическое тестирование, в том числе таргетное секвенирование методами NGS для диагностики.

После этого докладчик описал технологию MassARRAY для детекции вариантов методом масс-спектрометрии. Этот подход основан на определении массы ампликонов и позволяет получить результаты очень быстро. Этим методом в Центре определяют мутации в таких генах, как KRAS, NRAS, BRAF и PIK3CA при колоректальном раке. Среди преимуществ подхода Пьер-Жан Лэми отметил «прозрачный» процесс анализа, гибкость, высокие производительность и чувствительность и большие возможности в модификации процесса.

В качестве примера молекулярной диагностики опухоли докладчик описал процесс анализа материала жидкостной биопсии при немелкоклеточном раке легкого. Он особо подчеркнул преимущества использования плазмы, а не сыворотки, для жидкостной биопсии, так как при получении сыворотки в нее попадает генетический материал из разрушающихся клеток.

Продолжил секцию Алексей Цуканов из НМИЦ колопроктологии им. А.Н. Рыжих МЗ РФ с докладом «Синдром Линча — от молекулярной диагностики к клинике». Сначала докладчик описал синдром и привел его историю и статистику заболеваемости. Синдром встречается довольно часто — у 1 из 300 европейцев. При синдроме Линча риск развития рака толстой кишки составляет 80%. Наличие синдрома можно подтвердить только генетически.

Мутации при синдроме Линча возникают в генах системы репарации, поэтому для опухолей характерна микросателлитная нестабильность. Она служит первым признаком синдрома. На первом этапе генетического тестирования целесообразно изучить мутации в генах MLH1 и MSH2. Затем — большие перестройки в генах MLH1, MSH2 и EPCAM. Уже после этого можно переходить к использованию панелей, полноэкзомному и полногеномному секвенированию. Докладчик привел пример постановки диагноза пациентке с синдромом Линча.

В России чаще встречаются мутации в гене MLH1, поэтому поиск мутаций целесообразно начинать с него. С другой стороны, в Европе и США чаще встречаются мутации в гене MSH2. Существует множество генетических диагностических критериев, и они постоянно пересматриваются.

Екатерина Алексеева из Медико-генетического научного центра им. академика Н.П. Бочкова выступила с докладом «Значение низкопенетрантных и мозаичных мутаций при диагностике ретинобластомы». Ретинобластома — наиболее частая детская интраокулярная опухоль сетчатки глаза; опухоль может носить спорадический или наследственный характер. Ранняя диагностика очень важна.

Среди мутаций в гене RB1 часть обладает полной пенетрантностью (эти мутации приводят к полному отсутствию белка), а часть — неполной (эти мутации уменьшают количество нормального белка pRB или частично его инактивируют).

Исследовали 22 семьи с ретинобластомой, выявили отвечающие за болезнь мутации. Таже обнаружили 11 бессимптомных носителей, у одного из них мутация была обнаружена в мозаичном варианте. Исследование показало, что низкопенетрантные герминальные мутации в гене RB1, унаследованные от отца, чаще приводят к возникновению ретинобластомы и чаще — в более тяжелой форме. Также низкопенетрантные мутации в гене RB1 увеличивают риск развития других новообразований.

Еще одна причина разнообразия фенотипических проявлений одинаковых мутаций — соматический мозаицизм. Обнаружение мозаицизма сопряжено с различными трудностями. Так, нужен углубленный биоинформатический анализ, а выявленные мутации нельзя подтвердить секвенированием по Сэнгеру. Частота мозаицизма в литературе сильно варьирует. Если у пациента выявили мутации в гене RB1 в мозаичном варианте, то он не унаследовал их от родителей, и нет необходимости в молекулярно-генетическом исследовании сибсов.

Продолжила секцию Ирина Демидова из Московской городской онкологической больницы № 62 ДЗМ с докладом «Исследование циркулирующей опухолевой ДНК в практической онкологии». Жидкостная биопсия изучает не только циркулирующую опухолевую ДНК (цоДНК), но и циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК), метилирование и экзосомы. Ее используют для ранней диагностики, установлении стадии заболевания, выявления остаточной болезни радикально пролеченных пациентов, определения риска метастазирования и мониторинга.

Ирина Демидова перечислила преимущества (например, получение ксенографтов) и недостатки (дороговизна) исследования ЦОК, а также цоДНК (малое количество материала).

Экзосомы практически полностью отражают структуру родительской клетки — ДНК, РНК, микроРНК, протеины, часть антигенов на поверхности. Ирина Демидова считает, что в будущем их изучение будет иметь большое значение.

В предыдущих исследованиях не удалось успешно использовать цоДНК и ЦОК для скрининга колоректального рака. Изучают возможность применения этих маркеров для оценки успешности радикального лечения. Но уже сейчас цоДНК и ЦОК используют при лечении рака легкого.

В конце докладчица обратила внимание на важность правильного получения и первичной обработки образцов, а также хранения.

С докладом «Молекулярная генетика параганглиом» выступила Анна Кудрявцева из Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва). Параганглиомы растут медленно и обычно имеют слабую симптоматику. Однако у многих параганглиом есть признаки злокачественности, также они способны к метастазированию. До 40% параганглиом наследуются. Из-за их редкости было сложно набрать достаточное количество образцов. Но с 1990-х годов собрали уже около 200 образцов.

Параганглиомы различают по степени инвазии в стенки артерий. От этого зависит стратегия лечения. Хотелось бы уметь предсказывать, будет ли опухоль обладать признаками злокачественности, и насколько она агрессивна.

В параганглиомах часто нарушена активность генов, участвующих в цикле Кребса. Команда Анны Кудрявцевой выявила ряд генов, в которых чаще всего встречаются мутации при этом типи опухолей (для российской выборки). Выявили несколько сигнатур, часть которых характерна и для других типов опухолей. Также выявили множество вариантов при секвенировании, но патогенность большинства из них установить не удалось из-за малого числа образцов. В настоящее время идут опыты на рыбках данио и других модельных объектах.

Антон Пушкин из НМИЦ онкологии МЗ РФ (Ростов-на-Дону) выступил с докладом «Диагностический потенциал циркулирующих микроРНК при глиомах высокой степени злокачественности». Вначале докладчик кратко рассказал о глиальных опухолях, их распространенности и особенностях. Причины этого заболевания неизвестны, но небольшой процент глиом связан с наследственными опухолевыми синдромами, например, синдромом Линча.

Диагностика глиом ассоциирована с рядом трудностей. Часть из них связана с ограничениями метода МРТ. Зачастую для диагностики приходится прибегать к хирургическому вмешательству.

Большую роль в диагностике могут сыграть микроРНК. Их определяют в сыворотке, спинномозговой жидкости, плазме и т.д. Эти биомаркеры активно исследуются. В НМИЦ онкологии проверили, можно ли использовать микроРНК как маркер для диагностики глиом высокой степени злокачественности. Для оценки уровня экспрессии использовали RT-PCR.

Выделили две микроРНК, has-miR-107 и has-miR-122-5p, которые обладали высокой диагностической чувствительностью и специфичностью. Исследование расширили, но получили слишком много потенциальных маркеров. Чтобы их сократить, провели машинное обучение. Получили две панели по 15 и 14 микроРНК. Их сейчас валидируют методом RT-PCR.

Владимир Стрельников из Медико-генетического научного центра им. академика Н.П. Бочкова (Москва) продолжил секцию с докладом «Эпигенетические маркеры чувствительности опухолей молочной железы к неоадъювантной химиотерапии». Докладчик начал с того, что на данный момент практически нет способов предсказать, как РМЖ отреагирует на неоадъювантную химиотерапию. Экспрессионные сигнатуры использовать не удалось.

Ученые попытались подойти с другой стороны и выполнить метиломный анализ, разделить образцы на подгруппы, выделить наиболее информативные маркеры метилирования, создать диагностические панели из ограниченного количества маркеров метилирования ДНК. Но и тут исследователей постигла неудача. Причина, в том числе, в ограниченности используемых инструментов.

Группа из Медико-генетического научного центра им. академика Н.П. Бочкова ведет разработку метиломных маркеров чувствительности опухолей молочной железы к неоадъювантной химиотерапии. Она использовала бисульфитное секвенирование. Все опухоли разделились на умеренно метилированный и гиперметилированный подтипы, но ассоциаций с другими признаками найдено не было.

И все же удалось выбрать маркеры, которые коррелируют с хорошим и плохим ответом на неоадъювантную химиотерапию. Хороший ответ коррелирует с гиперметилированием CpG-островков. Пока оценки скорее субъективные, метод дорабатывается. Но было показано, что для оценки эффективности достаточно двух маркеров.

Антон Буздин из Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва) выступил с докладом «О чем может сказать профиль РНК-секвенирования опухолевого образца». Он начал выступление с описания проблем, с которыми сталкивается персонализированная терапия в онкологии. Мутационный анализ не позволяет сделать выбор тактики лечения в 80–90% случаев онкозаболеваний. Он информативен только для 40 таргетных препаратов из 170, доступных на рынке.

Решение — рассмотреть транскриптомные профили опухоли. С их помощью можно моделировать сигнальные пути опухоли и ее ответ на препараты. То есть с помощью РНК-секвенирования можно оценить ожидаемый клинический эффект препарата по данным генной экспрессии. РНК также достаточно хорошо сохраняется в парафиновых блоках. Идеальным был бы протеомный уровень анализа, но технологически это очень сложно. РНК-секвенирование можно найти даже неизвестные типы фьюженов, в отличие от панелей.

Мишени таргетной терапии можно измерять на уровне отдельных генов, а также рассчитывать активность молекулярных путей, которые таргетируют те или иные препараты, с помощью РНК-секвенирования. Потом можно рассчитать общий показатель эффективности, который зависит и от того, и от другого.

Антон Бузин отметил платформу Oncobox для анализа РНК и генома опухоли. Она прошла КИ и уже используется в клинике.

Продолжила секцию Татьяна Кекеева из «Медико-генетического научного центра им. академика Н.П. Бочкова (Москва) с докладом «Анализ дефицита гомологичной рекомбинации как предиктора к ингибиторам PARP». Она описала механизм ингибиторов PARP. Они вызывают специфическиую гибель опухолевых клеток, у которых есть дефицит гомологичной рекомбинации. Такой дефицит определяется двумя путями — HRRm-тест (мутации генов гомологичной рекомбинации) и GIS-тест (геномная нестабильность). Оба эти подхода — косвенные, но были реализованы во многих исследованиях, таких как Paola-1.

По результатам исследований только гены BRCA1/2 были приняты как предиктивные маркеры. В Европе только мутации в этих генах являются маркерами первого уровня клинической значимости (мутации герминальные, соматические и опухолевые). Однако по результатам исследования Profound приняли панель из 15 генов HRR как предиктор к эффективности олапариба.

Геномная нестабильность оценивается как суммарная оценка по специальной шкале, которая учитывает потерю гетерозиготности, аллельный дисбаланс и крупные геномные перестановки. Для определения геномной нестабильности существуют два подхода — NGS и хромосомный микроматричный анализ.

Дефицит гомологичной рекомбинации как предиктивный маркер имеет ряд ограничений — нет стандартного метода определения, нет популяционных данных, он не отражает состояние гомологичной рекомбинации в режиме реального времени и т.д.

Завершил секцию Дмитрий Михайленко из Медико-генетического научного центра им. академика Н.П. Бочкова (Москва) с докладом «Молекулярно-генетическая диагностика при раке простаты и мочевого пузыря». Существуют рекомендации, при каких условиях пациента направляют на генетическое тестирование с подозрением на наследственный рак простаты. Также определен перечень генов-кандидатов RUSSCO. И сейчас в России доступна NGS-панель для такого рода диагностики.

Однако не все из этих 15 генов обладают высокой предиктивной ценностью. Например, наличие или отсутствие мутаций в гене ATM не подскажет лучший способ лечения, в отличие от BRCA. А ген PPP2R2A будет исключен из списка со следующего года.

По мнению докладчика, будущее — за тестами, которые позволят пациентам с неоперабельным раком менять линии таргетной и комбинированной терапии на основе комплексного профилирования соматических мутаций, оценки статуса HRD и MSI, а также качественное определение PD-L1. Пока таких панелей немного.

В рекомендациях при раке мочевого пузыря ничего пока не меняется — при определенных условий следует задуматься о синдроме Линча. Также Дмитрий Михайленко отметил недавние КИ препаратов для лечения рака мочевого пузыря. Ведется поиск прогностических маркеров.

Информация о выступающих

Пьер-Жан Лэми, Страсбургский университетский госпиталь, Страсбург, Франция|

Цуканов Алексей Сергеевич, д.м.н., ФГБУ «НМИЦ колопроктологии им. А.Н. Рыжих» Минздрава России, Москва

Алексеева Екатерина Александровна, ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова», Москва

Демидова Ирина Анатольевна, к.м.н., ГБУЗ «Московская городская онкологическая больница № 62 ДЗМ», Москва

Кудрявцева Анна Викторовна, к.б.н., ФГУН «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва

Пушкин Антон Андреевич, ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, Ростов-на-Дону

Стрельников Владимир Викторович, д.б.н., доцент ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова», Москва

Буздин Антон Александрович, д.б.н. Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, Москва

Кекеева Татьяна Владимировна, к.м.н., ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова», Москва

Михайленко Дмитрий Сергеевич, к.м.н., доцент ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова», Москва