МД-2021, день 2. Компания «Вектор-Бест». Молекулярная диагностика в онкологии

Симпозиум начался со вступительного слова директора по науке компании «Вектор-Бест» Эдуарда Аглетдинова.

Он отметил, что пандемия нового коронавируса во всех странах стала серьезным испытанием для системы практического здравоохранения, потребовала перераспределения ресурсов и мощностей, что повлекло за собой вынужденное отвлечение внимания медицинского сообщества от многих других актуальных медико-биологических проблем. В связи с этим в ближайшее время можно опасаться значительного роста проблем, связанных с другими заболеваниями, в том числе — онкологическими. Осознанием этого был обусловлен выбор тем симпозиума.

Первый доклад под названием «Фармакогенетическое тестирование при синдроме Жильбера у больных со злокачественными новообразованиями» представила Людмила Любченко, профессор НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова.

Синдром Жильбера — наследственное заболевание, при котором снижается активность УДФ-глюкуронозилтрансферазы 1-1 (UGT-1A), кодируемой геном UGT1A1, что приводит к повышению содержания свободного билирубина. Для синдрома характерна желтуха, имеющая волнообразное течение.

Далее Людмила Любченко подробнее рассказала о гене UGT1A1 и связанных с ним ферментах, а также о другом ассоциированном с этим геном заболевании — синдроме Криглера — Найяра 1 и 2 типов.

От наличия мутаций в гене UGT1A1 зависят эффективность и риск развития побочных эффектов при полихимиотерапии у раковых больных. Генетическое тестирование на маркеры, связанные с UGT1A1, рекомендуется при подготовке к химиотерапии во многих странах. В России подобное тестирование требуется при назначении схем терапии FOLFOX и FOLFIRI, применяющихся при колоректальном раке.

Далее Людмила Любченко рассказала о научно-исследовательской работе, проводившейся в ее лаборатории на базе онкологического центра в 2018–2019 годах. Работа была посвящена разработке диагностической панели для оценки эффективности и токсичности полихимиотерапии у пациентов с раком прямой кишки. От панели требовались точность, совместимость с имеющимся оборудованием и минимальные времязатраты.

По результатам исследования в 2019 году был получен патент. После этого исследовательская деятельность в данном направлении была закончена. В настоящее время лаборатория сотрудничает с компанией «Вектор-Бест».

В 2021 году компания «Вектор-Бест» зарегистрировала набор «РеалБест-Генетика UGT1A1», предназначенный для исследования числа повторов 5ТА/6ТА/7ТА/8ТА в гене UGT1A1. Набор используется для выявления синдром Жильбера и других заболеваний, а также для предупреждения побочных эффектов при химиотерапии.

Набор отличается простотой в использовании, скоростью получения результата и дешевизной. Для ПЦР используется готовая реакционная смесь. Набор позволяет исследовать несколько маркеров в одной реакции. Материалами для исследования могут быть кровь или буккальный эпителий.

В качестве примера использования набора Людмила Любченко привела клинический случай — обратилась пациентка возрастом 23 года с диагнозом рак яичников и рак прямой кишки, а также с гемато- и гепатотоксичностью. По результатам исследования был выявлен синдром Жильбера. Установленный генотип по гену UGT1A1 был ассоциирован с повышенной токсичностью при использовании препарата иринотекана. С учетом результатов исследования первичная доза иринотекана для пациентки была снижена вдвое.

В завершение Людмила Любченко еще раз обратила внимание на то, что предложенные компанией «Вектор-Бест» методологические решения направлены на более эффективное и безопасное использование лекарственных средств. Она поблагодарила компанию за помощь в адаптации наборов к ежедневной деятельности лаборатории.

Следующий доклад «Возможности молекулярно-генетического анализа в дооперационной диагностике новообразований щитовидной железы: собственный опыт и перспективы» прочитал Сергей Титов, старший научный сотрудник лаборатории ПЦР «Вектор-Бест».

Вначале Сергей Титов рассказал о наиболее часто применяемом способе дооперационной диагностики рака щитовидной железы — тонкоигольной аспирационной биопсии. Ткань, полученную с помощью биопсии, отправляют на цитологическое исследование, где ее относят к одной из пяти категорий по системе Bethesda. Цитологический анализ довольно точен, однако 10–20% образцов все еще попадают в неопределенные категории — неясное значение или подозрение на опухоль. В таких случаях невозможно установить злокачественность или доброкачественность опухоли. Таких пациентов обычно отправляют на операцию по удалению одной доли щитовидной железы. Дальнейший анализ обычно показывает, что 70–80% удаленных новообразований были доброкачественными.

По словам Сергея Титова, основная цель молекулярной диагностики в данном случае —снижение числа ненужных оперативных вмешательств. Он рассказал об уже существующих и доступных на рынке тестах производства ThyroSeq, Afirma и ThyGeNEXT-ThyraMIR.

Далее докладчик рассказал о маркерах, которые они применяли в своих исследованиях — микроРНК, мРНК, соматические мутации и содержание митохондриальной ДНК. МикроРНК, например, позволяет выявить папиллярный тип рака — при нем происходит существенное повышение концентрации микроРНК 146b.

Распределение мутаций также отличается в разных типах рака — при папиллярном раке чаще встречаются мутации в гене BRAF, а мутации RAS встречаются во всех типах рака, включая доброкачественные фолликулярные аденомы.

Наиболее показательным маркером оказался ген HMGA2 — его экспрессия значительно повышается при папиллярном и фолликулярном типах рака.

Сергей Титов отдельно отметил, что анализируемое ими соотношение ядерной и митохондриальной ДНК не используется в других тестах. Этот маркер позволяет выявить клетки Гюртле (B-клетки щитовидной железы), что важно для определения B-клеточных вариантов фолликулярного рака.

Далее докладчик описал алгоритм принятия решения при типировании. Вначале определяется, относится ли образец к паращитовидной или к щитовидной железе, затем — является ли опухоль злокачественной или доброкачественной, и, наконец, тип злокачественной опухоли. Всего при типировании используют семь маркеров.

В разных исследованиях специфичность и чувствительность данного алгоритма варьировала в пределах 89–93%. Так как основной целью является снижение количества ненужных оперативных вмешательств, предсказательная ценность отрицательного результата (ПЦОР) подобного теста — более важный параметр, чем предсказательная ценность положительного результата (ПЦПР). Количество ложноположительных результатов не должно превышать 5%.

Докладчик отметил, что ПЦОР разработанного ими алгоритма сопоставим с тестами зарубежного производства (более 95%), при этом значения ПЦПР были более высокими. Медуллярный, папиллярный и B-клеточный раки типируются почти со 100%-ной точностью, а фолликулярный рак — с меньшей точностью.

Таким образом, предложенная панель маркеров и алгоритм ее применения позволяет с высокой точностью отличать новообразования щитовидной и паращитовидной железы, выявлять злокачественные опухоли, а также типировать все типы рака щитовидной железы, кроме фолликулярного.

На вопрос о готовности нового метода к внедрению в клиническую практику Сергей Титов ответил, что работы по его усовершенствованию продолжаются, а Эдуард Аглетдинов добавил, что результаты, получаемые с использованием текущего варианта методики, в настоящее время используются клиницистами как вспомогательные в рамках научно-исследовательских работ.

Завершающий доклад симпозиума под названием «Выявление новообразований шейки матки в цитологических препаратах с помощью молекулярно-генетических методов: диагностический потенциал и ограничения вирусных и клеточных биомаркеров» представил начальник лаборатории ПЦР компании «Вектор-Бест» Михаил Иванов. Вначале он рассказал о цервикальном скрининге — систематическом тестировании на новообразования шейки матки у бессимптомных женщин. Скрининг несет две основные цели — диагностика и прогноз рисков.

Для проведения скрининга выделяется определенная группа риска по возрасту, для которой чаще всего проводится либо совместное тестирование на вирус папилломы человека (ВПЧ) и цитологическое исследование, либо только ВПЧ-тестирование с направлением на дополнительное исследование при положительном результате.

Целью исследования компании «Вектор-Бест» было создание небольших панелей, позволяющих повысить надежность и информативность цервикального скрининга. Михаил Иванов отметил низкие показатели специфичности и предсказательной точности применяемых в данный момент методов: чувствительность цитологического исследования составляет в среднем около 68%, специфичность — около 85%. ВПЧ-тест позволяет достичь 100%-ной чувствительности, но обладает низкими параметрами специфичности — около 64%. При этом по последним рекомендациям ВОЗ допустимо принятие решения о лечении на основе одного скрининга.

В рамках исследования были проанализированы 340 цитологических препаратов от пациенток с разными диагнозами — проведено ВПЧ-тестирование с генотипированием и определением вирусной нагрузки, анализ микробиома, уровня метилирования вирусной и клеточной ДНК, экспрессии ряда генов.

ВПЧ-тестирование показало малую ПЦПР. Концентрация вируса далеко не всегда отражала тяжесть поражения. Иногда при тяжелых случаях не удавалось обнаружить ДНК вируса вовсе.

Все прочие молекулярные методы показали лучшую специфичность. Так, частота метилирования клеточных и вирусных генов возрастала с увеличением тяжести поражения и отличалась между легкими и тяжелыми поражениями. Изменения состава цервикального микробиома, исследованного методами 16S секвенирования и наборами компании «Вектор-Бест», выраженно коррелировали с тяжестью поражения.

Наиболее информативным и одновременно технически простым оказался анализ изменения концентрации ряда мРНК и микроРНК с помощью ПЦР в реальном времени, который позволил различить легкие и тяжелые поражения даже при использовании одиночных маркеров.

Было разработано несколько вариантов линейных молекулярных классификаторов, основанных на анализе экспрессии реципрокных пар мРНК и микроРНК. Их использование позволило достичь специфичности более 90% при выявлении тяжелых неоплазий, что существенно превосходит возможности ВПЧ-тестирования. В случаях несовпадения результатов молекулярного теста с цитологическим заключением для одного и того же препарата результаты дополнительного анализа экспрессии ряда генов, вовлечённых в цервикальный онкогенез, в большинстве случаев подкрепляли результат молекулярного теста.

Для окончательного выбора оптимального классификатора требуется валидация разработанных методик на типах опухолей, для которых у исследователей пока нет требуемого количества охарактеризованных цитологических образцов.

Михаил Иванов также обратил внимание на простоту разработанных классификаторов — стандартный ВПЧ-тест анализирует 17 молекул, в то время как новые классификаторы — всего 4–8 молекул; при этом они позволяют достичь ПЦОР 99,5–99,9%. Так же, как и в случае с тестированием на новообразования щитовидной железы, ПЦОР в данном случае является более важным показателем, так как стоит цель — освободить проходящих скрининг пациенток от дальнейших ненужных медицинских вмешательств.

В завершение доклада Михаил Иванов сформулировал промежуточные выводы по представленной работе: анализ предложенных маркеров можно использовать для увеличения специфичности и положительной предсказательной ценности молекулярно-генетического анализа при обследовании ВПЧ-положительных пациентов, а также для выявления ВПЧ-отрицательных патологий шейки матки, составляющих до 15% от их общего числа. Требуются масштабные испытания в формате «follow up» для оценки прогностической ценности методики.

Информация о выступающих:

Аглетдинов Эдуард Феликсович, д.м.н., заместитель генерального директора по научной работе АО «Вектор-Бест», Новосибирск

Любченко Людмила Николаевна, д.б.н., профессор, заведующая лаборатории клинической онкогенетики НИИ клинической онкологии им. Н.Н. Трапезникова ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава РФ

Титов Сергей Евгеньевич, старший научный сотрудник лаборатории ПЦР АО «Вектор-Бест»

Иванов Михаил Константинович, к.б.н., начальник лаборатории ПЦР АО «Вектор-Бест»