МД-2021, день 2. Молекулярная диагностика и эпидемиология природно-очаговых инфекций

Секцию открыл Бенуа Жоляк (Strasbourg University Hospital) докладом «Interest and limitations of molecular biology in investigations of Lyme borreliosis in France». Болезнь Лайма распространена в Европе, Азии и США. Возбудителей болезни, бактерий рода Borrelia, переносят иксодовые клещи. После укуса клеща-носителя заражаются менее 10% людей. Если болезнь оставить без лечения, могут развиться неврологические проявления или артрит. Жоляк отметил, что частота разных клинических проявлений различается в зависимости от части света.

Диагностика болезни Лайма сложна, так как бактерии очень редко встречаются в тканях и отсутствуют в крови. Референсным методом считается культивирование, но это длительный процесс.

Существует около 10 ПЦР-наборов для выявления боррелий, но ни один из них не был опробован на людях. По данным исследований, чувствительность ПЦР зависит от вида биоматериала. Самые высокие показатели зарегистрированы для кожных поражений (эритемы) и синовиальной жидкости.

Основным методом выявления инфекции является серологическое тестиирование. Однако Жоляк отметил, что для постановки диагноза нельзя использовать только его. В настоящее время для диагностики болезни Лайма используется триада: эпидемиологические данные, клинические данные, биологические (серологические) данные.

В 2021 году во Франции вышли рекомендации по болезни Лайма. Жоляк рассказал о них и о молекулярном типировании возбудителя. Типирование проводится методом MLST по восьми генам домашнего хозяйства либо по локусу OspC. MLST-профили боррелий разных видов можно найти в базе данных PubMLST. Докладчик также привел данные по клиническим профилям разных видов Borrelia.

После Жоляка выступила Людмила Карань (ЦНИИЭ) с докладом «Вспышка лихорадки Западного Нила в Москве». Вспышка произошла летом 2021 года. Карань рассказала о том, как проходило ее расследование. К этой инфекции очень чувствительны птицы. Первый случай ЛЗН у человека был зарегистрирован во время массовой гибели ворон в Москве. Когда инфекция у человека и ворон подтвердилась, выяснилось, что к тому времени в питомниках уже два месяца болели и умирали хищные птицы. Подробно о лихорадке Западного Нила в Москве — на PCR.NEWS.

Евгений Бондаренко (АО «Вектор-Бест») представил доклад «Исследование циркуляции возбудителя лихорадки Ку в регионах Сибири и Дальнего Востока». Возбудитель Ку-лихорадки — грамотрицательная бактерия Coxiella burnetii, единственный вид рода Coxiella. Бактерии присвоена II группа патогенности. Это облигатный внутриклеточный паразит, антропозооноз, имеющий широкий спектр хозяев и разнообразные пути передачи. В 60% случаев Ку-лихорадка проходит бессимптомно. Для остальных 40% характерно поражение верхних дыхательных путей. Кроме того, инфекция может перейти в хроническую форму с поражением сосудов. Ку-лихорадка очень опасна для беременных, так как вызывает акушерские осложнения.

Эндемичными по КУ-лихорадке считаются Африка (в частности, в Чаде и Египте коксиеллой заражены 70–80% верблюдов) и регионы Европы, например, Канарские острова (Испания). Для инфекции характерна эпизоотия и вспышки среди людей. Бондаренко рассказал о вспышке Ку-лихорадки в Европе, которая произошла в начале XXI века. К концу 2010 года в Нидерландах переболело около 4 000 человек, а причиной стала мода на мелкий рогатый скот и увеличение поголовья коз.

Очаги Ку-лихорадки в Западной Сибири впервые выявили в 1990-х гг. Ими стали животноводческие фермы. Говоря о заболеваемости среди людей, Бондаренко отметил эффект «верхушки айсберга». По его мнению, бóльшая часть случаев остается невыявленной.

Компания «Вектор-Бест» разработала тест на основе ПЦР в реальном времени на ДНК C. burnetii. В качестве мишени был выбран многокопийный ген IS1111. При этом компания не располагала клиническими образцами и проверку теста проводила на суспензии клещей, полученных из разных регионов России. Мишень выявили в этой суспензии и с помощью секвенирования подтвердили ее принадлежность C. burnetii. Затем тест применили к образцам от 63 больных из Улан-Удэ, у которых подозревали клещевые инфекции, и подтвердили инфекцию у одного из них. Это был скотник, который каждый день снимал с себя клещей. При этом в качестве диагноза был указан фарингит, и результату теста врачи были удивлены.

В 2018 году компания «Вектор-Бест» провела исследование совместно с одной из больниц Новосибирска. Ученые обнаружили восемь возбудителей в крови от 325 больных с лихорадкой и подозрением на клещевые инфекции. У девяти пациентов подтвердилась Ку-лихорадка — результаты ПЦР-теста проверили секвенированием. Кроме нуклеиновых кислот возбудителя были выявлены антитела к нему. Восемь из девяти пациентов отрицали контакт с животными, но все контактировали с клещами. Полученные результаты говорят о том, что в Западной Сибири циркулирует Ку-лихорадка и клещи могут быть ее переносчиками. Однако основным путем передачи инфекции считается аэрогенный контакт.

ДНК C. burnetii также выявляется в мокроте больных с подозрением на туберкулез (один случай из 94, рассматриваемых в Новосибирском НИИ туберкулеза). Данные, полученные в исследовании башкирских пациентов с туберкулезом, позволяют предположить коинфекцию Ку-лихорадки и туберкулеза.

Следующий доклад «Орбивирусы — потенциальные возбудители клещевых инфекций» представила Марина Сафонова (Противочумный центр). Орбивирусы относятся к арбовирусам, они переносятся клещами. Их эпидемический потенциал неизвестен. Докладчица назвала орбивирусы к «инфекциям в зале ожидания». Интерес к ним проснулся после 2010 года, когда набрали силу молекулярно-генетические методы.

Сафонова рассказала о вирусах Кемерово, Трибеч и Муко. Все три вируса циркулируют на территории Российской Федерации. Генетический анализ выявил 80-процентную нуклеотидную идентичность вирусов Трибеч и Муко — возможно, оба вируса относятся к одному виду. Учитывая данные о межвидовой реассортации между вирусами, можно предположить, что вирусы Трибеч и Муко представляют два геноварианта одного вида. По мнению Сафоновой, вирус Кемерово можно отнести к тому же виду. В пользу этого говорит антигенное сходство.

Еще один орбивирус — вирус Вад-Медани — выделяется в различных регионах Российской Федерации. Филогенетический анализ изолятов выявил межсегментную реассортацию, при этом реассортанты находятся в географически удаленных друг от друга регионах.

Эпидемический потенциал вирусов определяется по его эпидемиологической опасности. Величина последней складывается из опасности источника, опасности механизма передачи и восприимчивости. Каждый показатель оценивается по 20-бальной шкале, сумма баллов говорит о величине эпидемиологической опасности. Так, опасность вируса Кемерово по этой шкале средняя, Вад-Медани — низкая ближе к среднему. По словам Сафоновой, высокий потенциал генетической изменчивости орбивирусов делает из возможными источниками инфекции.

Сафонова отметила, что в изучении вируса Кемерово нет прогресса с 1970-хгг., так как нет медицинского интереса к лихорадке Кемерово.

После Марины Сафоновой выступил Марат Макенов (ЦНИИЭ) с докладом об РНК-вирусах группы Jingmenvirus (JLV — Jingmen-like viruses). Первый представитель этой группы, JMTV (Jingmen tick virus), был обнаружен в Китае, в округе Цзинмэнь. Основная особенность JLV — геном, состоящий из четырех сегментов. При этом два сегмента сходны с геномами флавивирусов, другие два — уникальны для JLV.

Вирусы группы JLV выявляются в клещах разных родов и укушенных ими пациентах. В России были обнаружены вирусы Alongshan и Yanggou.

Макенов рассказал о скрининге клещей, собранных в Московской области, на JLV и неожиданных результатах этого скрининга. Первичный анализ РНК, выделенной из клещей, с помощью вложенной ПЦР дал положительный результат для 27% Ixodes ricinus. Вирусные нуклеиновые кислоты детектировались не только во взрослых клещах обоих полов, но и в голодных личинках и нимфах. Это могло бы быть признаком передачи вируса между стадиями развития клеща, но исследователей насторожила высокая частота обнаружения. ПЦР-анализ ДНК, выделенной от клещей, без обратной транскрипции также дал положительный результат, что говорит о сомнительном качестве матрицы. Тогда ученые повторили ПЦР и ОТ-ПЦР с использованием нуклеаз, очищая матрицу от РНК и ДНК соответственно. Очищенная РНК от JLV-положительных клещей в этот раз дала отрицательный результат, а очищенная ДНК — положительный. Это говорит о том, что мишень — вирусный ген NS5 — встроен в геном клеща.

Присутствие NS5 в клещах подтвердили на культуре клеток I. ricinus. Глубокое секвенирование выявило регион размером 2432 п. о., содержащий NS5-подобную вставку размером 506 п. о. (NS5-like). ДНК других сегментов вируса обнаружено не было, как и не было гена NS5-like в иксодовых клещах других видов. При этом ген NS5-like выявлялся не только в московских клещах, но и в I. ricinus из других регионов. Филогенетический анализ выявил генетическое разнообразие вирусных вставок в московских клещах. Ученые предполагают, что вирусы группы JLV могут иметь ДНК-форму.

Марат Макенов также представил доклад «Летучие мыши — резервуарные хозяева эболавирусов. Гипотезы и факты».

Информация о докладчиках

Бенуа Жоляк, профессор, French National Reference Center for Borrelia, University Hospital of Strasbourg; University of Strasbourg, Federation of Translational Medicine, EA7290 Lyme borreliosis group, Institute of Bacteriology, Страсбург, Франция.

Людмила Станиславовна Карань, руководитель научной группы разработки новых методов диагностики природно-очаговых заболеваний, ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва.

Евгений Иванович Бондаренко, к. м. н., научный сотрудник лаборатории ПЦР АО «Вектор-Бест», Новосибирск.

Марина Викторовна Сафонова, лаборатория диагностики вирусных инфекций I-II групп патогенности, ФКУЗ «Противочумный центр» Роспотребнадзора, Москва.

Марат Темирханович Макенов, старший научный сотрудник ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва.