МД-2021, день 2. Молекулярная диагностика паразитарных и микотических инфекций

Секцию открыла Любовь Катаева (Тюменский НИИ краевой инфекционной патологии) докладом «Молекулярно-генетическая характеристика сочленов микропаразитоценоза при описторхозе». Описторхоз — это паразитарная инфекций, которую вызывают плоские черви рода Opisthorchis. Человек заражается при употреблении в пищу сырой или недостаточно термически обработанной рыбы. На долю Российской Федерации приходится 2/3 мирового ареала описторхоза. Местные случаи инфекции у людей зарегистрированы в 27 субъектах РФ. Самый напряженный очаг инфекции — Западная Сибирь.

Для описторхоза характерны поражения печени, поджелудочной железы и других органов. Инфекция способствует развитию первичного рака печени и поджелудочной железы и отягчает течение любого другого заболевания. В частности, описторхоз вызывает нарушения микробоценоза.

Катаева рассказала об исследовании микропаразитоценоза при описторхозе. Анализировали не только видовой состав микробов, но гены вирулентности бактерий. Работа была проведена на 275 образцах кала от пациентов с подтвержденной паразитарной инвазией. У всех пациентов был выраженный дефицит нормобиоты (бифидобактерий, лактобацилл и др.). В целом паразитарная инвазия была связана с появлением условно-патогенных микроорганизмов и грибков. Кроме того, в образцах детектировалась Klebsiella pneumoniae.

Секвенирование выделенных штаммов E. coli и K. pneumoniae, нацеленное на несколько участков генома, показало, что K. pneumoniae представлена весьма вирулентными типами O1 и O2. Кроме того, были выявлены маркеры антибиотикорезистентности. У больных описторхозом были выявлены энтеротоксические штаммы E. coli. Описторхоз был связан с большей вирулентностью и резистентностью бактерий, чем другие паразитозы.

Также было зарегистрировано нарушение микробоценозов у промежуточных хозяев червя — моллюсков (битинид) и рыб (карпов). Катаева завершила доклад выводом о негативном влиянии описторхооза на индигенную микробиоту. По ее мнению, молекулярно-генетические методы позволяют выявить потенциал патогенности сочленов микропаразитоценоза.

Следующий спикер Игорь Корниенко (ФИЦ Южный научный центр РАН) представил доклад «Молекулярная диагностика гельминтозов: результаты и перспективы». Он рассказал о проблемах молекулярной диагностики в паразитологии на примере дирофиляриоза — природно-очагового паразитарного заболевания, вызываемого нематодами рода Dirofilaria. Людей заражают два вида дирофилярий: D. repens (преимущественно подкожная инфекция) и D. immitis (преимущественно поражения печени). Корниенко также рассказал о случаях обнаружения дирофилярий в легком и лимфоузлах.

Промежуточные хозяева дирофилярий — комары, в том числе Aedes, Anopheles, Culex. Они переносят личинок червя. Корниенко отметил, что заболевамость дирофиляриозом высока в ЮФО, но в последнее время наблюдается расширение ареала инфекции в северном направлении. В период с 2016 по 2020 гг. специалисты Ростовского НИИ микробиологии отловили и проверили 6 200 комаров в разных областях России. Распространенность дирофилярий среди комаров составила 0,45%. У собак юга РФ зараженность достигает 14,4%.

Видовая идентификация дирофилярий затруднена из-за несовершенства методов. Микроскопическое исследование гистологических образцов трудоемко и занимает много времени. Существует быстрый ветеринарный тест Heartworm Ag на антиген червя в крови, однако он дает положительный результат только через 6–8 месяцев после заражения.

Различить D. repens и D. immitis можно по белковым профилям с помощью MALDI-TOF. Для анализа нужны головные концы самок червей. Теоретически можно использовать для этого и ПЦР, однако методы ПЦР-анализа не оптимизированы для дирофилярий, и такие исследования проводятся кустарно. Например, из-за отсутствия стандартных праймеров ученые пользуются праймерами из публикаций других ученых, и если в первом случае последовательности были подобраны плохо, ошибки будут кочевать из статьи в статью.

Еще одна проблема ПЦР-анализа дирофилярий — сложная пробоподготовка. ДНК в фиксированных гистологических образцах сильно деградирует.

Отвечая на вопросы слушателей, Корниенко рассказал о проблеме недообследованности. Так, инфекция D. repens чаще всего выявляется в области головы (под кожей и в глазах), потому что на голове ее лучше всего видно. Врачи редко проверяют на дирофиляриоз пациентов, которые жалуются на зуд.

После Игоря Корниенко выступила Анастасия Тараскина (НИИ медицинской микологии им. П.Н. кашкина) с докладом «Микозы в эру COVID-19. Роль молекулярной диагностики в постановке диагноза».

Во время пандемии повысилась частота инвазивных микозов (ИМ, например, инвазивного аспергиллеза и инвазивного кандидоза) и их летальность. При COVID-19 факторами риска ИМ являются попадание в ОРИТ, установка катетеров, терапия антибиотиками и иммуномодуляторами и нарушение эпителиальных барьеров под действием SARS-CoV-2.

Молекулярные методы, по мнению Тараскиной, хороши для уточнения границ видов грибов и их идентификации в чистых культурах. Золотым стандартом для идентификации грибов считается анализ ITS-регионов. Тараскина рассказала о схеме ДНК-баркодирования, которая применяется в этой области.

Самой острой проблемой является диагностика микозов. Традиционный метод диагностики микозов — морфологический. Он занимает много времени и осложнен фенотипической пластичностью видов грибов. Тараскина отметила важность этиологического определения возбудителя. Например, до пандемии у больных с инвазивным аспергиллезом преобладал A. fumigatus, во время пандемии его доля снизилась и выросла доля A. niger.

Докладчица рассказала о двух подходах к разработке ПЦР-тестов на грибковые инфекции. Первый — узкоспецифичный анализ. Этот подход использован при создании тест-систем MycoGENIE, Fungiplex и AsperGenius. Тараскина отметила, что этим системам есть куда совершенствоваться.

Второй подход — использование пангрибковых праймеров с последующим секвенированием. Длина праймера в этом случае должна быть не менее 150 п.о., а гомология с референсной последовательностью — не менее 98%.

Тараскина отметила, ПЦР-диагностику следует использовать только в том случае, если грибок был обнаружен микроскопически. Кроме того, результаты ПЦР-идентификации должны соответствовать ключевым морфологическим характеристикам.

При инвазивном кандидозе необходимо определить патоген до вида, так как от вида зависит схема лечения. Так, в последние 10 лет в мире распространяется высоко контагиозный грибок Candida auris. В 2017 году он появился в Москве, в 2017–2019 распространился в ЦФО и Сибири, в 2019 был впервые выявлен в Санкт-Петербурге и сейчас циркулирует в ковидных стационарах.

C. auris делится на четыре клады, и каждая клада имеет свою лекарственную чувствительность. По словам Тараскиной, С. auris, распространившаяся в Санкт-Петербурге, пока чувствительна к эхинокандинам. Согласно ITS-типированию, российские изоляты относятся к кладе 1. Полногеномное секвенирование выявило их связь с южноазиатскими штаммами и мутации устойчивости к флуконазолу.

Александр Лукашев (Институт медицинской паразитологии, тропических и трансмиссивных заболеваний им. Е.И. Марциновского) выступил с докладом «Молекулярная диагностика в паразитологии: проблемы и перспективы». Он рассказал о низкой выявляемости паразитарных инфекций в России. Официальные данные говорят о снижении случаев, особенно бросается в глаза резкое падение заболеваемости паразитозами с 2019 по 2020 гг. По мнению докладчика, причина кроется в недостаточной диагностике и несовершенной системе регистрации таких заболеваний.

Однако при зарегистированных 200 тыс. случаев в России продано около 20 млн. упаковок противопаразитарных препаратов. Это происходит из-за большого количества интернет-ресурсов о паразитах. Такие ресурсы не имеют отношения ни к системе здравоохранения, ни к научным институтам.

Лукашев рассмотрел проблему на конкретных примерах. Так, эхинококкоз регистрируется с частотой менее 300 случаев в год. При этом 2–3% населения ЮФО имеют специфические антитела. В геномных базах представлены нуклеотидные последовательности всего 30 изолятов из России. Но это не считается проблемой. Как и дирофиляриоз и другие паразитарные инфекции, которые вызывают беспокойство в США и Европе, но не в России.

Что с диагностикой? Существует проблема перекрестной реакции ИФА-тестов на аскаридоз и токсокароз. Микроскопический анализ кала на гельминты и простейшие проводится либо после самой примитивной пробоподготовки, либо после ускоренной очистки методом Parasep, хотя последний не подходит для простейших. Из-за высокой нагрузки врачи не соблюдают нормы по времени просмотра препарата. Можно сказать, что микроскопия уходит, но молекулярная диагностика пока не пришла.

По мнению Лукашева, места для молекулярной диагностики в скрининге на паразитозы нет. Выделять ДНК из фекалий сложно, спектр возможных патогенов огромен, недостаточно мощностей у организаций. Скорее всего, идея скрининга молекулярными методами нежизнеспособна.

Для идентификации патогенов можно было бы использовать секвенирование гена 18S рРНК, составлять так называемый протистом образца (по аналогии с анализом микробиома секвенированием гена 16S рРНК).

Следующий участник, Александр Девятов (ЦСП ФМБА), представил доклад «Применение ПЦР для диагностики паразитарных заболеваний и мониторинга окружающей среды. Вызовы и возможные решения».

В России существуют зарегистрированные наборы для детекции нуклеиновых кислот паразитов, например, в линейках «АмплиСенс», «АльфаЛаб» и других. Однако они хорошо работают лишь с уже очищенной ДНК. Между тем пробоподготовка представляет серьезную проблему. Документы, регламентирующие молекулярную диагностику паразитарных инфекций, нацелены только на простейших, предполагают ПЦР с последующим электрофорезом и содержат непонятные инструкции.

Девятов рассказал об опыте создания теста на паразитов в ЦСП ФМБА. Первый шаг — подбор праймеров и их проверка in silico. Следующая проблема — хранение образца. Наименее травматичным для ДНК оказалось просто замораживание биоматериала без консервантов. Затем оптимизировали пробоподготовку. Одна из задач — разрушение прочных стенок цист и яиц. Команда ЦСП проверила несколько коммерчески доступных решений и остановилась на наборе QIAmp PowerFecal c шариками, к которому добавляли протеиназу K.

Следующая проблема — ингибиторы ПЦР, содержащиеся в фекалиях. Слабый положительный эффект давала отмывка ДНК.

Девятов также рассказал о трудностях концентрации яиц паразитов из почвы и кала. Среди возможных вариантов для почвы — флотация, то есть обработка образца раствором такой плотности, чтобы частицы почвы оседали на дно емкости, а яйца всплывали. Эта техника была отработана на яйцах токсокар. ДНК выделяется из тонкой пленки, собранной с поверхности раствора. Для фекалий возможно как концентрирование яиц на магнитных иммуношариках, так и разрушение яиц прямо в образце с последующей концентрацией ДНК, также на иммуношариках.

По мнению Девятова, самый сложный этап в разработке наборов — выделение ДНК.

После Девятова выступил Александр Матис (Institute of Parasitology of the University of Zurich) с докладом «Molecular identification of arthropod vectors». Матис сделал краткий обзор существующих молекулярных методов и привел сравнение LAMP и ПЦР. Он рассказал о разработке LAMP-идентификации комаров — переносчиков инфекций на примере Aedes aegypti. Этапы разработки включали оптимизацию праймеров и реакционной смеси. Итоговый тест работал с чувствительностью, позволяющий выявить 1 яйцо Aedes aegypti в 99 или 1 особь в 49 на других стадиях.

Матис отметил, что LAMP можно адаптировать к полевым условиям и использовать для мониторинга Aedes aegypti, и рассказал о методах сбора яиц комаров и их подготовке к анализу.

Другой метод идентификации членистоногих — MALDI-TOF MS, но для него не существует коммерческих баз данных. В настоящее время такую базу собирает швейцарская компания Mabritec и приглашает ученых к сотрудничеству. С помощью MALDI-TOF MS специалисты компании выявили новые для Швейцарии виды комаров Aedes: Ae. koreicus, Ae. japonicus, Ae. cretinus.

Завершил секцию доклад Марии Аслановой (ЦСП ФМБА) «Перспективы применения методов молекулярной диагностики при осуществлении мониторинга за паразитарными инфекциями на территории РФ». Асланова свела в один список все проблемы, которые существуют на этом поле. Она отметила, что паразитозы угрожают не только здравоохранению, но и экономике. Их распространению способствуют миграции населения и природные катастрофы.

России нужны современные диагностические методы. Существующие подходы работают не очень хорошо. Более того, высокоэффективные методы заменяются примитивными. Кроме того, специалисты подготовлены недостаточно, и в целом наблюдается отсутствие интереса к проблеме.

Информация о докладчиках

Любовь Владимировна Катаева, д. м. н., ведущий научный сотрудник лаборатории клиники и иммунологии биогельминтозов ФБУН «Тюменский научно-исследовательский институт краевой инфекционной патологии» Роспотребнадзора, Тюмень.

Игорь Валерьевич Корниенко, д. б. н., главный научный сотрудник ФГБУН «ФИЦ Южный научный центр РАН», Ростов-на-Дону. Представленная работа выполнена в соавторстве с учеными ФБУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону.

Анастасия Евгеньевна Тараскина, к. б. н., заведующая лабораторией молекулярно-генетической микробиологии Научно-исследовательского института медицинской микологии им. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург.

Александр Николаевич Лукашев, д. м. н., профессор, Институт медицинской паразитологии, тропических и трансмиссивных заболеваний им. Е.И. Марциновского, Москва.

Александр Андреевич Девятов, ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, Москва.

Александр Матис, профессор, Институт паразитологии Университета Цюриха, Цюрих, Швейцария.

Мария Михайловна Асланова, к. б. н., старший научный сотрудник лаборатории санитарной микробиологии и паразитологии ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, Москва.