МД-2021, день 2. Молекулярные методы в воспроизводстве и защите растений

Секция, посвященная растениям, впервые включена в программу «Молекулярной диагностики».

Первым выступил Олег Баранов (Институт леса НАН Республики Беларусь) с докладом «Молекулярно-генетические подходы к определению устойчивости лесных древесных растений к инфекционным болезням». Он обозначил два вопроса в области защиты леса: мониторинг болезней и селекционная работа.

Устойчивость растений к патогенам зависит от нескольких факторов. Один из них — так называемая биологическая устойчивость. Для определения биологической устойчивости можно использовать несколько подходов: генотипический (часто более генотипически богатые виды более устойчивы); микросателлитный анализ уровня плоидности (триплоидная осина более устойчива к инфекциям); индивидуальные (контроль генетического профиля при клонировании).

Известны генетические локусы, определяющие степень защиты растения. Например, локус PALAR3 ассоциирован с устойчивостью ели европейской (Picea abies) к еловой корневой губке (паразитическому грибу Heterobasidion annosum). Кроме того, может присутствовать маркер-ассоциированная устойчивость, то есть значимо связанная с нуклеотидной последовательностью, функции которой неизвестны.

Баранов рассказал об исследовании устойчивости проростков сосны к грибку фузариуму в условиях холодового стресса по сравнению с нормальными условиями. В работе были выявлены гены, ассоциированные с устойчивостью, экспрессия которых повышалась при холодовом стрессе. Из около 3 000 кандидатных генов значимыми оказались не более 10. Эти гены относились к разным физиологическим системам, то есть, по словам докладчика, они представляли собой разные инструменты для решения одной задачи. При этом внутри каждого инструмента наблюдалась генетическая вариабельность.

Еще одна задача в области защиты растений, которую можно определить с помощью молекулярных методов, — определение порогового количества патогена, необходимого для запуска инфекции. Это можно сделать, анализируя титры ДНК возбудителя в инфицированных тканях. Наконец, кроме того, можно оценивать вирулентность патогенов по уровню экпрессии соответствующих локусов.

Баранов считает, что если встает выбор между устойчивостью растений и продуктивностью, нужно остановиться на устойчивости. Нет смысла говорить о продуктивности, если растение не может справиться с инфекциями. Необходимо учитывать эколого-генетические аспекты устойчивости — факторы среды, обеспечивающие нормальную работу соответствующих генов.

После Баранова Станислав Пантелеев (Институт леса НАН Республики Беларусь) представил доклад «Генетическая диагностика возбудителей трансмиссивных заболеваний лесных древесных растений». В роли переносчиков инфекций растений выступают насекомые, паукообразные, нематоды и грибы. Переносчики помогают преодолеть главный барьер растения — механический. Кроме того, они преодолевают расстояния и передают инфекцию от больных деревьев здоровым. В случае грибов это происходит следующим образом. В клетках гриба могут содержаться вирусы, патогенные для растений, но не наносящие вреда самому грибу. Эти вирусы разносятся вместе с грибными спорами.

Исследовать возбудителей заболеваний можно с помощью секвенирования ПЦР-продуктов, анализа T-RFLP и фрагментного анализа. Каждый метод имеет ограничения. Так, секвенирование требует больших денежных и временных затрат, разные виды могут иметь количественно одинаковые T-RFLP и так далее.

Затем Пантелеев рассказал о методах выделения ДНК из разных переносчиков и о диагностических маркерах. Последние можно использовать как для определения самих переносчиков, так и для определения возбудителей. Докладчик обратил внимание, что существуют универсальные праймеры, однако они работают все хуже. Идентификацию грибов можно проводить по локусу ITS1 и по гену 5,8S рРНК. Для определения бактерий лучше использовать ген 23S рРНК — традиционные праймеры на ген 16S рРНК срабатывают на мтДНК жуков-переносчиков и на хлоропластную ДНК самого растения. В настоящее время ведутся работы по оптимизации праймеров на 16S рРНК.

Пантелеев пример примеры выявления переносчиков и инфекций в лесных хозяйствах с помощью секвенирвоания локусов ITS1/ITS4. В частности, выяснилось, что кладоспоридии переносятся жуками, мухами и паутинным клещом, Fusarium oxysporum — личинками жуков.

Следующим прозвучал доклад Елены Бондаревой (МГУ им. М.В.Ломоносова) «Особенности молекулярной идентификации почвенных микромицетов при выращивании древесных растений», записанный заранее. Работа проведена на образцах почвы, отобранных из ризосферы и посадочной ямы, а также на образцах фоновой почвы. В работе рассмотрены плодовые и декоративные культуры — оба варианта представлены яблонями. Молекулярная идентификация проводилась с помощью секвенирования ПЦР-продуктов, полученных с ДНК чистых культур микромицетов. Бондарева отметила разнообразие эколого-трофических групп в образцах и присутствие не только фитопатогенных грибков, но и видов, опасных для человека. Также докладчица обратила внимание на увеличение доли фитопатогенов с глубиной в слое 5–20 см, что может быть связано с накоплением корневого опада.

Александра Орина (ФГБНУ ВИЗР) выступила с докладом «ДНК грибов в зерне — объективный показатель качества».

В зерне всегда присутствуют грибы родов Alternaria и Fusarium. Они производят метаболиты — микотоксины, опасные для человека и животных. Качество зерна определяется количеством микотоксинов. При этом существующие ГОСТы регулируют только содержание микотоксинов Fusarium, для Alternaria в России нет установленных норм.

В настоящее время ГОСТ по оценке качества зерна предполагает лишь визуальный анализ 100 зерен из каждой партии. Таким образом можно отобрать зерна, пораженные Fusarium, так как они имеют морфологические дефекты, но в целом специалисты уверены, что анализ недостоверен.

Микологический анализ, то есть выращивание грибков, полученных из зерна, на питательных средах занимает очень много времени: сам рост длится не менее 14 дней, а последующая идентификация может идти месяцами. Производитель зерна не может столько ждать.

Еще один вариант — микотоксикологический анализ, который проводится с помощью ИФА или ВЭЖХ МС/МС. На микотоксикологию зерно отправляется в том случае, если доля визуально «плохих» зерен превышает 1%. Анализ проводится за счет производителя. Орина отметила, что для животноводства зерно с высоким содержанием микотоксинов может привести к огромным убыткам, поэтому животноводческие хозяйства сразу отправляют товар на микотоксикологический анализ.

По мнению Ориной, что решением проблемы может быть количественная ПЦР. Это быстрый и чувствительный метод, который позволит не только оценить степень поражения зерна, что напрямую связано с количеством микотоксинов, но и провести видовую идентификацию грибов. Орина рассказала о своем исследовании, проведенном в 2017–2019 гг. на 208 образцах зерна (пшеницы, ячменя и овса) из трех федеральных округов России. Анализ содержания ДНК грибов проводился методом qПЦР. Кроме того, были оценены концентрации микотоксинов методом ВЭЖХ МС/МС.

Alternaria и ее микотоксины обнаружились в 100% образцов. Орина отметила рекордное содержание тенуазоновой кислоты в одной из проб — 87 мкг/кг. С количеством этого метаболита коррелировало содержание грибов Alternaria секции Alternaria. Представители Fusarium присутствовали в 28–62% образцов. В некоторых образцах содержание гостированных микотоксинов этих грибов — дезоксиниваленола и Т-2 токсина — превышали ПДК. Орина отметила, что актуальных микотоксинов значительно больше, чем нормируемых.

И для гостированных, и для негостированных метаболитов наблюдалась корреляция количества ДНК гриба-продуцента с их содержанием. Это означает, что qПЦР можно использовать для рутинного анализа.

Группа Ориной также провела модельное исследование для определения пороговых значений концентраций ДНК грибов. Рассчитанный критический предел — 5 000х10^-4 пг/нг.

Следующий спикер Наталия Дренова (Всероссийский НИИ карантина растений) представила доклад «Молекулярные методы диагностики карантинных фитопатогенов». При выявлении карантинных фитопатогенов необходимо следовать двум принципам: высокая производительность и нулевая толерантность к присутствию патогена. Молекулярные методы полностью соответствуют этим принципам.

Грибы и нематоды детектируются визуально, поэтому основная работа — это скрининг с отсеиванием растений, признанных незараженными, и исследование подозрительных. Для исследования используются подращивание и молекулярные методы. Бактериальное и вирусное заражение можно детектировать серологическими методами и ИФА.

По мнению Дреновой, среди молекулярных методов преимущество имеет ПЦР с детекцией по конечной точке. Это простой и дешевый метод с достаточной чувствительностью. Однако в карантинной диагностике обычно используется больше одного метода. Среди преимуществ молекулярных методов Дренова назвала чувствительность, специфичность и быстроту исполнения, универсальность и выявление патогенов в латентной форме.

Еще один существенный плюс — простота в подготовке кадров. Дренова отмечает, что обучение традиционным методам диагностики, например, идентификации по морфологическим признакам с использованием ключей, занимает много времени. Пробоподготовка с ПЦР по инструкции гораздо проще — студенты осваивают ее за три дня.

Есть и некоторые проблемы молекулярных методов, а именно вероятность контаминации, ингибирование реакции и необходимость использования стандартных реактивов. Дренова считает, что в этой области будущее за антиконтминационными подходами и амплификацией без выделения нуклеиновых кислот.

После Наталии Дреновой выступил Илья Камаев (Всероссийский НИИ карантина растений) с докладом «Молекулярно-генетические подходы к диагностике насекомых и клещей, имеющих фитосанитарное значение». Он перечислил ограничения морфологических методов: стадия жизненного цикла; полиморфизм признаков, в том числе диагностических; необходимость в дорогостоящем оборудовании (например, СЭМ) и обучении кадров; узкая специализация диагностов. Молекулярно-генетические методы преодолевают все эти ограничения.

Среди них — ДНК-баркодинг с использованием вариабельной части митохондриального гена COI. Он применяется в фитосанитарии и карантине растений. Ограничения метода — единственный генетический маркер и проблема референтных образцов. Кроме того, может происходить контаминация другими организмами. Например, в геномах насекомых из общедоступных баз встречаются грибные сиквенсы.

Молекулярные методы можно использовать для установления происхождения и путей распространения вредителей. Таким образом было установлено, что Австралия — центр видового разнообразия красного пальмового клеща, и оценена скорость инвазии каштановой минирующей моли.

Последним выступил Сергей Субботин (Plant Pest Diagnostic Center California Department of Food and Agriculture). Он представил доклад «Молекулярный анализ как основа для систематики фитонематод». Фитопаразитические нематоды могут поражать все части растения. Нематоды запускают заболевания, в которых участвует комплекс бактерии-нематоды-грибы. Самые опасные вредители — галловые нематоды, облигатные паразиты корней. Все галловые нематоды относятся к роду Meloidogyne, содержащему 90 видов. Диагностика их очень сложна, так как проводится по единственному признаку.

Появление молекулярных методов упростило задачу. Филогенетический анализ позволил разделить галловых нематод на 11 групп, при этом пять из них составляют суперкладу, охватывающую 75% изучаемых видов. Появилась и молекулярная диагностика, в первую очередь методом ПЦР.

Субботин привел несколько примеров из практики своей лаборатории. Так, его команда выявила персиковую нематоду и кофейную нематоду на плантациях США, а также техасскую галловую нематоду на саррацении.

Докладчик рассказал и о других методах, основанных на амплификации — LAMP и RPA. Cам Субботин предпочитает RPA. По его мнению, она имеет ряд преимуществ, одно из которых — возможность проведения анализа в полевых условиях.

Информация о докладчиках

Олег Юрьевич Баранов, д. б. н., зав. лабораторией геномных исследований и биоинформатики научно-исследовательского отдела генетики, селекции и биотехнологии ГНУ «Институт леса НАН Республики Беларусь», Гомель.

Станислав Викторович Пантелеев, к. б. н., старший научный сотрудник лаборатории геномных исследований и биоинформатики научно-исследовательского отдела генетики, селекции и биотехнологии ГНУ «Институт леса НАН Республики Беларусь», Гомель.

Елена Викторовна Бондарева, ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии (ВНИИФ), Московская обл., р.п. Большие Вяземы; факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва.

Александра Станиславовна Орина, к. б. н., научный сотрудник лаборатории микологии и фитопатологии, ФГБНУ ВИЗР — Всероссийский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

Наталия Васильевна Дренова, старший научный сотрудник ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт карантина растений» Россельхознадзора, Москва.

Илья Олегович Камаев, к. б. н., старший научный сотрудник ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт карантина растений» Россельхознадзора, Москва.

Сергей А. Субботин, Plant Pest Diagnostic Center California Department of Food and Agriculture, США.