Метилированные цитозины в ДНК можно обнаруживать на приборах PacBio

Метилирование ДНК, то есть присоединение СН₃-групп к цитозинам в составе CpG-динуклеотида с образованием 5-метилцитозинов (5mC), играет важную роль в эпигенетической регуляции генома, в том числе при онкогенном перерождении клетки. Наиболее широко используемый метод обнаружения 5mC — бисульфитное секвенирование (BS-seq), но у него есть существенные недостатки, в том числе высокая степень деградации ДНК из-за суровых условий протекания реакции. Идеальным был бы метод, применимый непосредственно к нативной ДНК без предварительного химического или ферментативного воздействия и без ПЦР-амплификации перед секвенированием.

Команда ученых из Китайского университета Гонконга предложила подход, который назвала холистической кинетической моделью (HK), для непосредственного исследования 5mC с помощью секвенирования единичных молекул в режиме реального времени на приборах PacBio   (SMRT-секвенирования). Для определения метилированных сайтов учитываются кинетические сигналы ДНК-полимеразы, используемой при секвенировании методом синтеза, а также контекст, в котором находится каждый нуклеотид.

Для обучения сверточной нейронной сети (CNN) использовали амплифицированную ДНК (неметилированную) и ДНК, обработанную ферментом метилтрансферазой (метилированную). После этого CNN детектировала метилированные цитозины в последовательности с 90%-ной чувствительностью и 94%-ной специфичностью.

Затем модель протестировали на гибридных фрагментах ДНК человека и мыши, различавшейся по статусу метилирования, а также на геномной ДНК человека из различных биологических образцов, таких как лейкоциты, плацентарные и опухолевые ткани. Общие уровни метилирования, рассчитанные моделью HK, хорошо коррелировали с уровнями, полученными BS-seq (r = 0,99; P < 0,0001) и позволяли оценить характер аллель-специфического метилирования в импринтированных генах.

По мнению авторов, анализ метилирования ДНК на основе HK модели открывает множество возможностей для генетических и эпигенетических исследований и может найти применение в молекулярной диагностике (например, в онкологии).

«Я смотрю на это с осторожным оптимизмом», — сказал Уинстон Тимп, доцент кафедры биомедицинской инженерии в Университете Джона Хопкинса, который много работал над изучением паттернов метилирования ДНК, в частности с использованием нанопорового секвенирования; аналогичные исследования проводят и другие группы. — Если они смогут продвигать и развивать его, инструмент станет доступным и другие смогут воспроизвести эти результаты, это будет очень интересно». Он добавил, что технология PacBio уже очень хорошо подходит для прямого определения другого типа метилированных азотистых оснований ДНК, 6-метиладенина, но гораздо хуже для прямого обнаружения 5-метилцитозина.