Метод CLIP позволяет редактировать ДНК с помощью ретровирусов и CRISPR-Cas

Предложен метод трансфекции клеток крупными участками ДНК с помощью лентивирусов, не способных интегрироваться в клеточный геном, и CRISPR-системы. Встраивание происходит за счет репарации с участием гомологичной рекомбинации, матрицу для которой доставляет лентивирус. Это позволяет контролировать место вставки, снижает цитотоксичность и обеспечивает длительную экспрессию трансгена. Метод, который авторы назвали CLIP, может применяться для создания клеточных вакцин против рака, а также для инжиниринга клеточных линий.

Credit:
123rf.com

Вставка крупных фрагментов ДНК с помощью ретровирусов — перспективный метод редактирования генома первичных клеток (полученных напрямую из организма). Однако при этом трансгены встраиваются практически в случайный участок ДНК, что снижает или полностью подавляет их экспрессию со временем. Ученые из Стэнфордского университета предложили для преодоления этих проблем помещать трансген или в рамке считывания нативного гена, или непосредственно перед ней, используя HDR — репарацию с участием гомологичной рекомбинации. Это поставит интегрированный участок под контроль регуляции гена-«хозяина», тем самым будет обеспечена долгосрочная и стабильная экспрессия трансгена.

Так появился метод CLIP (CRISPR for long-fragment integration via pseudovirus), который позволяет интегрировать длинные фрагменты ДНК в определенные сайты. Методы, комбинирующие CRISPR с доставкой генетического материала, например, в аденоассоциированном вирусе, предлагали и ранее, но они не позволяли вставлять большие участки (в случае AAV не более 4,7 килобаз).

Ученые сконструировали дефицитный по интегразе лентивирусный вектор (IDLV), чтобы доставлять шаблон для рекомбинации в вирусном РНК-геноме. IDLV с дефектной интегразой способен к упаковке вирусных геномов, они нормально направляются в ядро, но их способность встраиваться в случайный участок генома клетки сильно снижена. Псевдовирусный геном содержит последовательность, которую нужно интегрировать в клеточную ДНК, и эта последовательность окружена двумя участками, гомологичными гену-мишени. После трансдукции происходит обратная транскрипция вирусной РНК, и в клетке появляется двухцепочечная ДНК — донор для HDR.

Затем с помощью электропорации в клетки вводят CRISPR-рибонуклеопротеин (RNP), который содержит гидовую РНК и нуклеазу Cas9; он создает двухцепочечный разрыв в определенном месте генома хозяина, а затем происходит репарация с участием гомологичной рекомбинации. CRISPR-RNP также удаляет длинные концевые повторы (LTR) и другие элементы вирусного генома, которые могут мешать встраиванию трансгена.

На первом этапе тестирования CLIP ученые встраивали фрагмент ДНК в ген актина-β (ACTB) — наиболее распространенного цитоскелетного белка. Донорная последовательность, которую доставляли в геном клеток in vitro, содержала зеленый флюоресцентный белок GFP, окруженный участками, гомологичными последовательности перед стартовым кодоном гена-мишени, и сайты разрезания Cas9. Клетки анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии на 3-й, 5-й и 7-й день после внедрения CRISPR-RNP и убедились в том, что экспрессия GFP остается стабильной с течением времени.

Интересно, что авторы идентифицировали GFP-экспрессирующую популяцию даже в контроле, где в клетки не вводили CRISPR-RNP. Причина, видимо, в том, что псевдовирусы генерируют эписомальную (внехромосомную) ДНК, которая и экспрессировала трансген, однако такая экспрессия непродолжительна

Вставка генетической информации может происходить не только за счет HDR, но за счет негомологичного соединения концов (non-homologous end joining, NHEJ) или посредством остаточной способности IDLV к интеграции. Однако признаков такого встраивания не удалось обнаружить.

Затем авторы продемонстрировали, что метод CLIP способен инициировать встраивание трансгенов одновременно в два участка целевой ДНК, для чего использовали гены флуоресцентных белков GFP и mCherry, а в качестве мишеней — гены ACTB и RAB11A (кодирует белок, участвующий во внутриклеточном транспорте). Проточная цитометрия подтвердила, что встраивание происходит по заданным локусам.

Метод CLIP оказался нетоксичным: первичные Т-клетки, отредактированные с помощью CLIP, обладали примерно такой же выживаемостью, как и клетки дикого типа, в то время как другие методы трансфекции значительно снизило количество живых клеток уже через 24 часа.

Ученые также показали, что CLIP может использоваться для получения стабильной экспрессии генов, более крупных, чем флуоресцентные белки. Они доставили в клетку ген Cas13d — рибонуклеазы, которая может расщеплять специфические транскрипты и таким образом регулировать экспрессию тех или иных генов. Ген размером 2,9 т.п.н. интегрировали в гены-мишени с помощью CLIP-конструкции. Примечательно, что экспрессия рибонуклеазы в локусе IL2RG оказалось значительно ниже, чем в локусе ACTB, очевидно, из-за различия в уровнях экспрессии эндогенных белков. Затем клетки с экспрессией Cas13d в ACTB трансфицировали их еще одним лентивирусным вектором, который кодировал гидовые РНК для Cas13d, нацеленные на кодирующую последовательность CD46. Через трое суток после трансфекции экспрессия поверхностного белка CD46 в клетках снизилась вдвое, следовательно, Cas13d была активной.

CLIP-опосредованное внедрение Cas13d в локус ACTB первичных T-клеток давало более стабильную экспрессию, чем традиционная лентивирусная интеграция.

Затем ученые интегрировали CLIP и метод CRISPRa для долгосрочной активации экспрессии целевых генов. В этот раз в клетки доставляли конструкцию на основе другой нуклеазы, Cas12a, которая не разрезает мишень, но гиперактивна как регулятор активности генов через РНК-мишени. С помощью CLIP в клетки внедряли ген hyperdCas12a-miniVPR размером 6,4 т.п.н. Эта молекула представляет собой Cas12a, слитую с активатором транскрипции, и ее можно использовать для активации терапевтических программ в Т-лимфоцитах. Этот эксперимент также прошел успешно, изменение экспрессии целевых генов было мощным и стабильным.

Наконец, ученые с помощью CLIP «заставили» клетки стабильно экспрессировать антигены коронавируса SARS-CoV-2 — S-белок и РНК-зависимую РНК-полимеразу.

Таким образом, CLIP не только доставляет в клетки крупные участки ДНК, но и обеспечивает стабильный уровень их экспрессии. Эффективность интеграции предсказуема, что может оказаться полезным для производства терапевтических клеточных линий. Поскольку клеточные вакцины становятся многообещающим подходом к борьбе с раком, CLIP можно применять для редактирования антигенпрезентирующих и иных клеток для создания клеточных вакцин.


Split-PE — новый метод прайм-редактирования

Источник

Chavez, M., et al. Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus // Nature Biomedical Engineering (2023). May 1, 2023. DOI: 10.1038/s41551-023-01037-x

Добавить в избранное