Split-PE — новый метод прайм-редактирования

Праймированное редактирование с помощью CRISPR использует фермент Cas, соединенный с обратной транскриптазой, и гидовую РНК особого строения, которая не только распознает нужный участок, но и выступает в роли матрицы для редактирования. В новом исследовании показано, что ковалентно сшивать Cas и обратную транскриптазу необязательно. Это облегчает доставку редактирующей конструкции и ускоряет поиск новых систем редактирования.

Credit:

123rf.com

Метод праймированного редактирования генома (prime editing) разработали в Институте Бродов в 2019 году. Он позволяет вносить в ДНК довольно протяженные и точные исправления. Система для редактирования включает каталитически ослабленную нуклеазу Cas9, сшитую с обратной транскриптазой (RT), и особую гидовую РНК — prime editing guide RNA (pegRNA), которая не только направляет нуклеазу к нужному сайту ДНК, но и является матрицей для «переписывания» этого участка. Конструкция, направляемая pegRNA, садится на ДНК и разрезает одну цепь ДНК. Свободный конец pegRNA, содержащий праймерную последовательность, связывается со свободным концом ДНК, а затем обратная транскриптаза достраивает нить в месте разреза, используя pegRNA в качестве матрицы. Новый фрагмент ДНК занимает место исходной последовательности, и затем включаются клеточные механизмы репарации ДНК (подробнее). Поскольку обычно репарируется разрезанная нить, иногда используют другую CRISPR-конструкцию, которая разрезает вторую, неотредактированную нить, чтобы она «переписывалась» по первой.

Системы прайм-эдитинга показали высокую точность и эффективность, но размер белковой конструкции, объединяющей два фермента, очень велик, и это создает трудности при доставке кодирующих последовательностей в вирусных векторах. Теперь группа исследователей из США и Германии установила, что для праймированного редактирования необязательно ковалентно сшивать два фермента. Они исследовали на клетках в культуре конструкцию PE2 — никазу Cas9 бактерии Streptococcus pyogenes (nSpCas9), к С-концу которой пришита обратная транскриптаза вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV-RT). Сравнивали различные конфигурации, например, прикрепление MMLV-RT к N-концу или ее помещение внутрь кодирующей последовательности Cas9. Оказалось, что не связанные между собой белки nSpCas9 and MMLV-RT функционируют в человеческих клетках так же эффективно, как и другие варианты PE2 — точность редактирования осталась высокой как для замен, так и для инсерций и делеций. В одном векторе можно доставлять кодирующую последовательность nSpCas9, в другом — РНК и обратной транскриптазы.

Эту систему, которую авторы назвали Split-PE, можно использовать для быстрого поиска и оценки новых вариантов прайм-редакторов. Это, в частности, позволит расширить набор используемых обратных транскриптаз. Авторы проверили шесть укороченных мутантных форм MMLV-RT и нашли компактный вариант, не менее активный, чем родительский, а также оценили потенциал обратной транскриптазы Marathon-RT из Eubacterium rectale, которую часто используют в экспериментах in vitro.

Также исследователи показали, что PE2 можно разделить не между никазой и обратной транскриптазой, а внутри никазы, и снабдить интеинами (участками, необходимыми для белкового сплайсинга). Такую конструкцию тоже можно доставить в клетку в двух аденоассоциированных векторах, и в результате восстановится функциональный белок.

 

Двойное праймированное редактирование генома работает аккуратнее CRISPR-Cas9

Клетки человека отредактировали для устойчивости к болезни Альцгеймера

Источник

Julian Gruenewald, et al. Engineered CRISPR prime editors with compact, untethered reverse transcriptases // Nature Biotechnology, 2022. DOI: 10.1038/s41587-022-01473-1

Добавить в избранное