Метод EpiDamID позволяет одновременно изучить транскриптом и гистоновые модификации в единичных клетках

Область изучения единичных клеток в последнее время активно пополняется новыми методами, позволяющими помимо транскриптома узнать о связывании транскрипционных факторов или состоянии эпигенома. Метод DamID, предложенный ранее, использовал метилтрансферазу Dam, слитую с изучаемым белком. Особенность метода и его главное отличие от подходов, базирующихся на ChiP, в том, что генетическую конструкцию доставляли в живые клетки. Это позволило изучать не только взаимодействия «в моменте», а совокупную картину связывания изучаемого белка с ДНК за интересующий исследователей период, включая слабые и краткосрочные взаимодействия. Метод хорошо подходит для изучения белков, которые могут быть слиты с метилтрансферазой, но не для анализа модификаций гистонов. Для этой цели авторы работы разработали EpiDamID.

Принцип метода заключается в следующем. В клетку доставляют конструкцию, в которой белок, селективно узнающий определенную модификацию гистонов, слит с метилтрансферазой Dam. Для узнавания модификаций использовали mint-антитела (mintbody — modification-specific intracellular antibody, внутриклеточное специфическое к модификации антитело) или специфичные домены эукариотических белков.

Метилтрансфераза Dam метилирует аденозин в GATC-мотивах, находящихся недалеко от места связывания конструкции с ДНК. Метилированные мотивы GATC далее селективно расщепляют рестриктазой DamI, добавляя адаптеры для секвенирования. Параллельно проводят обратную транскрипцию всех полиаденилированных мРНК в клетке и затем секвенируют ее совместно с фрагментами ДНК, подвергшимися расщеплению по метилированным GATC-мотивам.

Метод валидировали на эмбриональных стволовых клетках мыши и мышиных эмбриоидных тельцах. Также генетическую конструкцию для изучения распределения метки H3K9me3, специфичной для гетерохроматина, доставляли в виде мРНК в эмбрионы рыбки Danio rerio. Как известно, именно на первых стадиях развития эмбриона происходит масштабное перераспределение гетерохроматина, и EpiDamID позволяет изучить его совместно с профилями экспрессии в соответствующих клетках.

Метод требует доставки генетической конструкции в клетки. Также его ограничение – это разрешение (полученный результат будет зависеть от распределения GATC-мотивов в ДНК).