Микрофлюидная CARMEN определяет десятки вирусов в сотнях образцов за часы

Ученые из США представили платформу microfluidic CARMEN (mCARMEN) для экономичного и быстрого обнаружения вирусов и их вариантов, которая сочетает диагностику на основе CRISPR с микрофлюидикой и оптимизирована для клинического использования. Авторы разработали панель для тестирования 21 респираторного вируса, включая SARS-CoV-2, другие коронавирусы и вирусы гриппа А и В, и продемонстрировали ее работоспособность в реальных клинических условиях. Статья опубликована в Nature Medicine (см. также препринт на medRxiv).

Разработка имеет долгую историю. В мае 2020 года исследователи из Института Бродов (MIT и Гарвард) опубликовали статью в Nature о платформе мультиплексированного обнаружения патогенов, которую назвали CARMEN (Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids). В ней используются капли с реагентами объемом около нанолитра, которые самоорганизуются в массиве микролунок. Идея возникла еще до появления SARS-CoV-2, а когда началась пандемия, авторы добавили в панель и этот вирус.

CARMEN-Cas13 представляет собой версию платформы SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing). Идея в том, что CRISPR-Cas-система одновременно разрезает РНК-мишень и молекулу-репортер нуклеиновой кислоты — например, полиурацил с флуоресцентной молекулой на одном конце и гасителем флуоресценции на другой; когда концы удаляются друг от друга, возникает флуоресцентный сигнал. Что касается микрофлюидной техники, она была создана в 2018 году в лаборатории Пола Блейни, доцента MIT и соавтора новой статьи. Чипы размером со смартфон содержат десятки тысяч микролунок, каждая из которых рассчитана на пару капель объемом в нанолитр. Для детекции используется две сливающиеся капли: одна содержит амплифицированный генетический материал из образца, а другая — реагенты, предназначенные для обнаружения вируса. Поскольку платформа использовала нуклеазу Cas13, для ее работы не нужны были гидовые РНК, достаточно более коротких CRISPR-РНК (crRNA). 

Каждый образец тестировался на наличие РНК, комплементарной одной из 169 crRNA, содержащихся в каплях с реагентами. Эта разработка позволяла детектировать до 169 вирусов в 8 образцах одновременно.

Однако первая версия технологии плохо подходила для клинических условий: нужны были специально изготовленные чипы и оборудование для считывания, процесс требовал ручной работы и занимал 8–10 часов. Теперь авторы представили обновленную версию, которая использует коммерчески доступные микрофлюидные и измерительные приборы Fluidigm. В результате mCARMEN может тестировать образцы 188 пациентов на наличие более 20 респираторных вирусов при затратах менее 10 долларов на образец. Время обработки удалось сократить до пяти часов. Экстракция РНК автоматизирована, ОТ-ПЦР проводится в один этап.

Диагностическую эффективность платформы проверили на 525 образцах пациентов в научной лаборатории и 166 образцах в реальных больничных условиях (в лаборатории клинической микробиологии Массачусетской больницы общего профиля).

Как mCARMEN, так и CARMEN v1 демонстрировали 100%-ную аналитическую специфичность, то есть не давали ложноположительных результатов. Но mCARMEN показал 100%-ную чувствительность при концентрацих вирусной РНК 100 копий/мкл и 98,4%-ную чувствительность к 10 копий/мкл (у CARMEN v1 — 86% и 77,8% соответственно).

Авторы создали дополнительную панель mCARMEN, позволяющую различать 6 вариантов SARS-CoV-2, в том числе дельту и омикрон, по 26 мутациям в S-белке. (Для этого требуется 26 пар crРНК.) Проверка на 2 088 образцах пациентов показала, что классификация вариантов практически идеально (97,9% совпадений) соответствует результатам NGS-секвенирования. В Институте Бродов использовали новую технологию для мониторинга омикрона в штате Массачусетс.

Наконец, авторы адаптировали модель для количественного определения вирусов, для чего потребовалось два разных эффектора CRISPR — белки Cas13 и Cas12 и специфичные для каждого из них репортерные молекулы. (Cas13 обладает повышенной чувствительностью по сравнению с Cas12, поэтому Cas12 обеспечивает детекцию больших количеств материала, а Cas13 — меньших количеств.) В таком виде технология позволяет измерять количество копий вирусов SARS-CoV-2 и гриппа А в пробах. 

Идеальная диагностика, отмечают разработчики, — это одновременная обработка сотен образцов пациентов, с обнаружением нескольких вирусов в каждом образце, дифференциацией вирусных вариантов и определением вирусной нагрузки. Таких тестов в настоящее время не существует, но mCARMEN может стать шагом в этом направлении.