Модификация белков Argonaute позволит выявить мишени микроРНК в отдельных клетках

МикроРНК — класс малых некодирующих РНК, регулирующих экспрессию белок-кодирующих генов. Выявление генов-мишеней микроРНК является важной научной задачей, однако существующие методы малоэффективны в отношении необходимого числа клеток, так как требуют считывания информации с миллионов клеток для получения результата. Это не только затрудняет анализ образцов с малым количеством материала, но и препятствует выявлению различий между отдельными клетками и типами клеток. Ученые из Швеции представили новый метод выявления мишеней микроРНК на отдельных клетках.

МикроРНК функционируют за счет направления белков группы Argonaute к таргетным матричным РНК (мРНК), где они либо препятствуют трансляции, либо провоцируют деградацию мРНК. Новый метод, получивший название agoTRIBE, работает за счет связывания белка Argonaute2 с РНК-модифицирующим доменом гиперактивного варианта белка ADAR2. ADAR2, таким образом, направляется к РНК мишеням вместе с Argonaute2, где производит замену аденозина на инозин вокруг места связывания Argonaute2. Эти замены затем можно считать путем секвенирования РНК (в виде A>G замен). Модификацию клеток ученые проводили при помощи трансфекции — прямого введения рекомбинантной плазмиды в клетку. Они также подтвердили, что в проведенных опытах связывание ADAR2 с Argonaute2 не меняло локализации последнего в клетке.

Авторы протестировали новый метод на линии HEK-293T, использовав примерно 50 000 клеток. Как и ожидалось, в модифицированных клетках количество A>G замен было повышено. При этом в клетках, модифицированных только на экспрессию ADAR2, количество A>G замен было значительно меньше. Для получения списка потенциальных мишеней микроРНК авторы сравнили количество A>G замен в гене в клетках, модифицированных agoTRIBE либо только ADAR2 (последние использовались как показатель «фоновой» неспецифической к мишеням микроРНК модификации).

Исследователи отобрали 1000 генов с наибольшим количеством замен по результатам модификации agoTRIBE и сравнили полученный список с наборами мишеней, выявленными другими методами. Для сравнения использовали различные варианты CLIP-секвенирования, в которых Argonaute связывается с его мишенью при помощи ультрафиолета и далее захватывается антителами, что позволяет напрямую секвенировать сайт прикрепления белка. Ученые обнаружили значительное пересечение между наборами генов, идентифицированными agoTRIBE и CLIP. Более половины выявленных agoTRIBE мишеней были идентифицированы одним или несколькими CLIP методами.

Авторы также сравнили результаты agoTRIBE с TargetScan — методом компьютерного предсказания мишеней микроРНК. В данном случае 112 генов было идентифицировано обоими методами, что в 1,8 раз больше, чем число генов, идентифицированных TargetScan и CLIP (62).

Для экспериментальной проверки результатов agoTRIBE авторы ингибировали активность микроРНК в клетках. Это приводило к повышению экспрессии генов, идентифицированных agoTRIBE, приблизительно на 15%, что соответствует данным об эффекте микроРНК на уровень экспрессии генов-мишеней.

Группа также представила несколько вариаций agoTRIBE, включающие в себя флуоресцентные метки. Их эффективность авторы также проверили в сравнении с клетками, модифицированными только на экспрессию ADAR2.

Наконец, исследователи продемонстрировали потенциал agoTRIBE для сравнения функции микроРНК между различными клетками — они применили его к клеткам на разных стадиях клеточного цикла. Методика позволила выявить ряд генов, подвергающихся большему влиянию микроРНК на определенных стадиях цикла и показать, что гены, непосредственно участвующие в клеточном цикле, не подвержены регуляции со стороны микроРНК.

Представленный метод выявления генов-мишеней микроРНК, таким образом, не требует применения антител и позволяет анализировать отдельные клетки.