Молекулярная диагностика против лекарственной устойчивости бактерий

Тринадцатого апреля 2021 года на экспертной площадке МГУ «Диалог о настоящем и будущем» состоялся семинар «Технологии быстрого определения устойчивости к антибиотикам на уровне индивидуального пациента». Обсуждались возможности технологий point-of-care — быстрой диагностики в местах оказания медицинской помощи, состояние этих технологий в мире и в России.

Credit:

Alexander Gospodinov | 123rf.com

Это первый семинар цикла «Борьба с инфекциями» Междисциплинарной научно-образовательной школы МГУ «Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология» на экспертной площадке «Диалог о настоящем и будущем». Семинар был посвящен одной из самых острых проблем в современной медицине — устойчивости патогенных бактерий к антибиотикам. Особую важность она приобретает в конкретных клинических случаях: врачу необходимо как можно быстрее понять, какими устойчивыми штаммами бактерий заражен больной и какими антибиотиками его нужно лечить. Обсуждались возможности и перспективы технологий point-of-care (РОС) — быстрой диагностики в местах оказания медицинской помощи, буквально у постели больного, состояние этих технологий в мире и в России.

Дискуссию модерировала Татьяна Припутневич, директор Института микробиологии, антимикробной терапии и эпидемиологии Национального медицинского исследовательского центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова Минздрава России.

    

С первым докладом «Технологии point-of-care в диагностике лекарственной устойчивости патогенов: разработка, применение, перспективные направления» выступил Дмитрий Грядунов, заместитель директора Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Он начал с данных ВОЗ: в 2018 году в странах «большой семерки» лекарственная устойчивость микроорганизмов оказалась на пятом месте среди причин смертности. По прогнозу на 2050 год, в этих странах от лекарственно-устойчивых инфекций умрет 10 миллионов человек — больше, чем сейчас умирает от рака. С приходом COVID-19 ситуация ухудшилась, так как многие страны отказались от практики острожного применения антибиотиков, и это приведет к новому взрыву численности устойчивых микроорганизмов.

Сегодня специалисты выявляют новые механизмы формирования лекарственной устойчивости, большинство из них связаны со способностью микробных клеток эффективно выводить антибиотики.

Дмитрий Грядунов обозначил важнейшие цели, которые преследует контроль резистентности бактерий к антибиотикам: быстрый выбор правильной стратегии лечения, предотвращение внутрибольничного заражения пациентов устойчивыми патогенами, молекулярная эпидемиология лекарственно-устойчивых форм возбудителей инфекций. Он привел два убедительных примера, которые доказывают: устойчивость бактерий к антибиотикам можно контролировать. Особенно важно то, что эти работы были сделаны в нашей стране.

Первый пример — туберкулез. Особенность этого патогена, подчеркнул Грядунов, в том, что туберкулезная палочка в лаборатории растет медленно — 2–3 месяца, и все это время, пока нет информации о чувствительности и устойчивости патогена, больной получает стандартный коктейль препаратов. В таких условиях быстро вырабатывается лекарственная устойчивость.

Чтобы ускорить диагностику, исследователи из Института молекулярной биологии в сотрудничестве с учреждениями противотуберкулезной защиты в 2005 году выпустили набор реагентов для выявления лекарственной устойчивости бактерий к препаратам первого ряда — рифаипицину и изониазиду, и это стало революционным шагом в лечении туберкулеза. Однако в 2010–2011 годах появляются новые штаммы с широкой лекарственной устойчивостью, имеющие генетические детерминанты резистентности не только к препаратам первого ряда, но и второго ряда. Для борьбы с ними ученые сделали микрочип, который в течение суток позволял выявлять порядка 120 детерминант устойчивости к шести различным антибиотикам. (Подробнее о микрочипах, которые разрабатывают в ИМБ, в интервью с Дмитрием Грядуновым на PCR.NEWS.) Это уже давало возможность назначать персонифицированное лечение.

Затем встала другая задача: можно ли определить степень резистентности при наличии определенной генетической детерминанты? Если резистентность низкая, можно найти выход, увеличив дозу препарата. На основе этого подхода специалисты разработали клинические рекомендации.

Дмитрий Грядунов рассказал про исследование, в котором больные туберкулезом получали новейший препарат бедаквилин, а специалисты по ходу лечения проводили полногеномное секвенирование и наблюдали за изменением генетической структуры изолятов бактерий. И оказалось, что устойчивость к совершенно новому препарату, который никогда ранее не использовался в противотуберкулезной терапии, бактерии вырабатывают за два-три месяца. У больных при этом не было положительной динамики, а ученые выявили два новых  механизма выработки лекарственной устойчивости. Эти результаты, крайне важные для клиницистов, вошли в обновленные рекомендации ВОЗ 2019 года.

Однако есть и положительная сторона: заболеваемость туберкулезом в РФ после 2005 года снижается, а отказ от бездумного применения антибиотиков ведет к возвращению чувствительных штаммов. «Сегодня врачи поверили, что можно контролировать инфекцию, и благодаря этому наблюдается обратный процесс, — говорит Дмитрий Грядунов. — По крайней мере, в Москве картина меняется — в популяции туберкулезных бактерий устойчивые к антибиотикам штаммы замещаются чувствительными».

Второй пример, в котором ученым в сотрудничестве с клиницистами удалось взять лекарственную устойчивость под контроль, касается гонококков — возбудителей гонореи. Мониторинг лекарственной инфекции в регионах с помощью микрочипа начали в 2012 году. Выяснилось, что у гонококка быстро растет резистентность к пенициллину и тетрациклину, которые сейчас исключены из терапии, но для цефалоспоринов 3-го поколения динамика резистентности незначительна. Ученые сделали еще один микрочип на возможные мутации вывода антибиотика из клетки.

Мониторинг показывает, что в России ситуация с лекарственной устойчивостью гонококков, в отличие от некоторых других стран, достаточно благоприятная, да и заболеваемость гонореей падает.

Переходя к обзору имеющихся технологических возможностей для оценки антибиотикорезистентности, Дмитрий Грядунов отметил, что у нас есть дорогостоящие тесты, проводимые в лабораториях, и они хорошо работают на анализ простых мишеней, то есть обнаружение отдельных геномных маркеров антибиотикорезистентности. Однако тесты быстрой диагностики по месту нахождения пациента для нашей страны он все же отнес к категории будущего. А потребность в таких тестах есть — в первую очередь для борьбы с возбудителями сепсиса, грибковыми инфекциями, внутрибольничными инфекциями.

Использовать NGS секвенирование для диагностики point-of-care, по оценке докладчика, слишком сложно и затратно, да и не очень быстро. Интересен подход, связанный с детекцией нуклеиновых кислот посредством ядерно-магнитного резонанса (время анализа 3–6 часов), хотя он требует предварительной амплификации. Одобрена за рубежом и в России технология GeneXpert (США), где анализ клинического материала происходит внутри картриджа, полностью автоматически, с результатом менее чем за два часа: его минус — высокая стоимость. В последние годы возник бум применения CRISPR-биосенсоров в диагностике (системы SHERLOCK), но здесь есть технологические сложности, связанные с активностью ферментов. Наконец, Грядунов рассказал про так называемую «пончиковую ПЦР» (donut PCR), разработку бывшего сотрудника Института молекулярной биологии РАН. С «пончиком» авторы сравнивают кольцевой канал на чипе, в котором циркулирует реакционная смесь, нагреваясь и охлаждаясь до температур, необходимых для ПЦР. «За счет конвекционной ПЦР амплификация идет достаточно быстро, и в этой же зоне находится микрочип. Заявлены очень высокие характеристики — 50 геномных мишеней, количественный анализ за 10–30 минут».

Подводя итог, Дмитрий Грядунов подчеркнул, что технологии point of care — это наше будущее, благодаря скорости анализа и автономности, возможности использования вне лабораторий. То, что Россия отстает в подобных технологиях, это факт. И причина не столько в уровне молекулярной биологии, сколько в развитии нано- и микросистемной техники.

 

С докладом «Современные молекулярные методы выявления антибиотикорезистентности: что нужно России» выступил Герман Шипулин, заместитель генерального директора по научно-производственной деятельности Центра стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью ФМБА России.

Для начала он в цифрах показал роль инфекционных болезней в нашей жизни — в 2016 году в мире они были на втором месте по смертности, уступая сердечно-сосудистым заболеваниям, но обгоняя рак, — и привел слова Луи Пастера: «Господа, последнее слово будет за микробами». Чтобы не проиграть микробам, человеку необходимо быть в постоянной боевой готовности, что означает постоянный эпидемиологический контроль, разработку новых вакцин и лекарств. Антибиотики — великое изобретение, но их роль в снижении смертности от инфекций, первоначально очень высокая, сейчас снижается. «Как только мы разрабатываем новый антибиотик, тут же появляется опция резистентности, и сейчас мы не имеем ни одного антибиотика, к которому не было бы механизмов резистентности», — сказал Герман Шипулин. Основные проблемные, полирезистентные возбудители инфекций объединяют в группу ESKAPE (Enterobacter, Staphylococcus, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas, Enterococcus). некоторые штаммы клебсиеллы, по сообщениям зарубежной литературы, сочетают резистентность с гипервирулентностью.

Рассказ о ситуации в нашей стране докладчик начал словами: «В России, как всегда, все гораздо хуже». Для многих ключевых инфекционных болезней эпидемиологический надзор не налажен (пример — внутрибольничные инфекции). Из-за ведомственной разобщенности объем информации о биологических угрозах, получаемый лабораториями Роспотребнадзора, не превышает 10%. Эффективность диагностики для инфекционных болезней не превышает 30–40%, а некоторые, например, внебольничные пневмонии, вообще не расшифровываются. В первичном звене здравоохранения нет средств лабораторной диагностики, а в масштабах страны отсутствуют референсные центры, за исключением принадлежащих к РПН. Принятый в 2016 году пилотный проект «Обеспечение эпидемиологической безопасности медицинской помощи» работает неудовлетворительно.

Вместе с тем Герман Шипулин привел и пример эффективного эпиднадзора, который на высоком методическом уровне проводят специалисты группы члена-корр. РАН Романа Козлова в Смоленской государственной медицинской академии. «Благодаря им, а не благодаря Росздравнадзору, мы имеем данные о том, что происходит с антибиотикорезистентностью», — отметил он. В последнее время возросла доля инфекций, вызванных максимально резистентными микроорганизмами. Распространяются клоны с почти 100%-ной резистентностью к некоторым антибиотикам.

Переходя к лабораторной диагностике, Герман Шипулин подчеркнул ограниченность микробиологического (культурального) подхода. Основная сложность, с которой сталкиваются микробиологи, состоит в том, что многие микроорганизмы невозможно культивировать. Однако это не значит, что бактериологию нужно отбросить, потому что развиваются не только молекулярные методы, но и методы бактериологии. Так, появились современные приборы, в которых сочетаются культуральные (микрофлюидные) и молекулярные методы на чипах.

Обзор технологий молекулярной диагностики Герман Шипулин начал с вывода, сделанного авторами метаанализа 2017 года, посвященного инфекциям кровотока: «Если мы очень быстро меняем антибиотики в процессе использования молекулярных методов, то значительно снижаем риск летальных исходов. Методы молекулярной диагностики должны стать стандартом помощи пациентам с инфекционными заболеваниями».

При невозможности объять необъятное необходимо классифицировать антибиотикорезистентные бактерии по приоритетам борьбы с ними. С точки зрения докладчика, бактерии критического приоритета — это Acinetobacter baumanni, Pseudomonas aeruginosa, резистентные к карбапенемам, Enterobacteriacae, резистентные к карбапенемам и (или) цефалоспоринам 3-го поколения.

Что касается технологий, то 99% платформ для молекулярной диагностики антибиотикорезистентности основаны на ПЦР в реальном времени. Тренды технологий заключаются в закрытости платформы под реагенты, полной автоматизации, произвольном доступе, расширенном портфолио и скорости работы.

Герман Шипулин представил несколько успешных платформ. Cистема РОС от GenMarkDx — самая большая панель маркеров сепсиса (62 мишени патогенов, 10 локусов резистентности), время анализа всего полтора часа. Платформа Unyvero — 21 патоген, 15 групп генов резистентности, время анализа 4-5 часов. Панель тестов BioFire FilmArray Pneumonia Plus — 18 бактериальных и 9 вирусных возбудителей, 7 групп генов резистентности, время анализа около часа.

На территории России сегодня используется более 6000 амплификаторов («Сейчас, наверное, уже больше 8000, благодаря ковиду», — отметил Шипулин), более 600 автоматических станций для выделения нуклеиновых кислот. С помощью этого оборудования службы здравоохранения могут идентифицировать ДНК нескольких антибиотикорезистентных бактерий и анализировать гены резистентности. Однако для сложных механизмов резистентности, включающих множество вариантов генетических изменений, неприменимы простые тесты на основе методов амплификации нуклеиновых кислот, нужно использовать NGS. При этом требуются специальные усилия для правильной трансляции генетических данных в фенотипические.

Докладчик обозначил и еще одну проблему, связанную с тем, что нам не известны все механизмы мутационной изменчивости, то есть мы всегда понимаем, с чем связана резистентность бактерии к данному антибиотику. Для огромного количества мутаций нет данных об их влиянии на патогенность. Поэтому, если для одних бактерий секвенирование генома позволяет предсказать резистентность к большинству (не всем) антибиотикам, то для других бактерий такое предсказание невозможно.

В конце доклада Герман Шипулин перечислил, что необходимо России для развития молекулярных методов выявления антибиотикорезистентности:

  • быстрые генетические тесты point-of-care для прямого обнаружения патогенов из группы ESKAPE;

  • автоматические системы для быстрой бактериологической идентификации резистентности;

  • исследования новых механизмов резистентности;

  • базы данных полных геномов с автоматическими «пайплайнами» для их анализа;

  • наконец, нужен Национальный центр сбора и анализа генетических данных.

 

В обсуждении докладов приняли участие приглашенные эксперты и слушатели семинара. Специалисты отмечали необходимость развития молекулярных методов диагностики антибиотикорезистентности, которые должны стать проще и доступнее и таким образом приблизиться к больному, но также подчеркивали, что нельзя отказываться и от бактериологического подхода. Говорили о необходимости создания централизованных баз генетических данных, о трудностях в интерпретации результатов молекулярных тестов и необходимости обучения врачей. Молекулярные методы должны занять свое место в терапии инфекционных заболеваний, а технологии point-of-care — стать стандартом персонифицированного лечения.

Добавить в избранное

Вам будет интересно