Мутация в гене SGIP1 вызывает ранний паркинсонизм
Болезнь Паркинсона генетически крайне разнородна, но известно, что ранний паркинсонизм могут вызывать мутации в генах синаптических белков. Международный коллектив ученых выявил мутацию в гене SGIP1, которая вызывала ранний паркинсонизм в арабской семье. Эксперименты на дрозофилах подтвердили участие этой мутации в развитии болезни, а также связали патогенез с нарушением протеостаза и дисфункцией синапсов.
Credit:
VLAAMS INSTITUUT VOOR BIOTECHNOLOGIE | пресс-релиз
Паркинсонизм — это генетически и клинически гетерогенный синдром, который характеризуется тремором, ригидностью мышц и брадикинезией. Известны моногенные формы заболевания, которые развиваются из-за рецессивных мутаций в генах SH3GL2, SYNJ1 или DNAJC6, которые кодируют эндофилин А1, синаптоджанин 1 и ауксилин — белки с важными для работы синапсов функциями. Такие мутации вызывают форму паркинсонизма с ранним началом. Недавно международная группа ученых выявила мутацию в еще одном гене — SGIP1, — которая стала причиной раннего паркинсонизма в семье из Омана.
Изначально ученые рассматривали клинический случай двух сестер из арабской семьи. Их родители состояли в кровном родстве. У одной из сестер в 10 лет развились асимметричный тремор, прогрессирующая брадикинезия и ригидность мышц конечностей. Ее состояние немного улучшилось после приема леводопы и прамипексола — противопаркинсонических препаратов. Однако затем у нее развилась постуральная неустойчивость, выражающаяся в том числе в частых падениях, и поведенческие симптомы: вспышки гнева, приводившие к насилию в адрес родственников, проблемы в выполнении когнитивных и умственных задач. В возрасте 30 лет эта женщина набрала 41 балл по шкале Movement Disorders Society Unified Parkinson Disease Rating Scale, что указало на наличие паркинсонизма. У сестры пациентки похожая симптоматика развилась в 22 года; у нее также наблюдались моторные и когнитивные симптомы, которые улучшались после приема противопаркинсонических препаратов, а в возрасте 28 лет она набрала 46 баллов по той же оценочной шкале. Кроме того, у сестры пациентки с 10 лет периодически случались судорожные припадки. Сестрам поставили диагноз идиопатической болезни Паркинсона (БП) после проведения позитронной эмиссионной томографии, которая выявила характерные для моторных и когнитивных проявлений БП паттерны активности мозга. Генетическое тестирование не выявило известных мутаций, вызывающих БП.
Единственная кандидатная мутация, которую удалось найти с помощью генетического тестирования, располагалась в гене SGIP1 и до сих пор не была описана. Обе пациентки оказались гомозиготными носителями миссенс-варианта этого гена с заменой тимина на гуанин в 2080 позиции в 22 экзоне. Их родители — гетерозиготные носители этого же варианта. На аминокислотном уровне мутация вызывает замену триптофана на глицин (W694G), что приводит к нарушению структуры и стабильности белка, вызывая тем самым потерю его функции.
SGIP1 — довольно консервативный белок, поэтому эксперименты по исследованию его функций и влияния мутации на них ученые проводили на плодовых мушках. У дрозофилы экспрессируется ортолог SGIP1 — dSgip1, причем дестабилизированный мутацией домен белка на 49% идентичен человеческому на аминокислотном уровне, а затронутые мутацией аминокислоты консервативны и у людей, и у дрозофил. Ученые показали, что SGIP1 дикого типа и мутантный белок локализуются на пресинаптических окончаниях нейронов. При этом в основном SGIP1 сосредоточен в так называемых периактивных зонах синапса — в участках, где происходит эндоцитоз синаптических везикул. Также исследователи выяснили, что экспрессия мутантного белка была примерно на треть ниже по сравнению с белком дикого типа, что указало на сниженную стабильность мутантной формы.
Чтобы оценить влияние потери функции dSgip1, ученые провели нокаут экзона 1 гена dSgip1 с помощью CRISPR/Cas9, а также получили еще одну линию дрозофил с нокином того же экзона, которую использовали в качестве дополнительного контроля вместе с мушками дикого типа. Дрозофилы с нокаутом жили значительно меньше других мушек. Также они передвигались медленнее и преодолевали более короткие расстояния, вместе с тем выполняя больше микродвижений.
При раннем паркинсонизме часто возникают эпилептические припадки, которые наблюдались и у одной из пациенток. Исследователи решили проверить, склонны ли мушки к таким припадкам. Чтобы спровоцировать припадок, мушек пугали: либо давили на них, либо крутили на вортексе. Дрозофилы с нокаутом после этого начинали двигаться быстрее, но их движения не были скоординированы и они часто падали, что ученые и интерпретировали как припадки. Также припадки у дрозофил можно вызвать повышением температуры. Мушек помещали в температуру 38℃ и засекали время, через которое их парализовывало. У дрозофил с нокаутом паралич наступал спустя 55 минут инкубации, а у мушек дикого типа и мушек с нокином его вовсе не наступало.
Гистологическое исследование мозга молодых и старых мушек подтвердило наличие нейродегенерации. Она наблюдалась в основном у старых (25 дней) мушек с нокаутом. Исследователи также провели электрофизиологический анализ: для этого они получали мушек с белыми глазами, у которых постоянное облучение светом вызывало бы стресс, помещали их либо в емкость с постоянным освещением, либо в темную емкость и записывали электроретинограмму, чтобы отследить реакцию мушек на короткие секундные пульсы света. У мушек с нокаутом, которые находились в постоянном освещении, значительно снизилась амплитуда деполяризации, что связано с дегенерацией фоторецепторов.
Для БП характерна потеря дофаминергических нейронов. У старых мушек дикого типа и с нокаутом количество таких нейронов не изменялось. Однако у дрозофил с нокаутом значительно уменьшилась площадь синапсов дофаминергических нейронов в грибовидных телах — структурах мозга насекомых, которые регулируют память, сон, движение и другие процессы.
Далее ученые попытались понять, как именно потеря функции dSgip1 может влиять на работу синапсов. Сначала они проверили, мешает ли мутация образованию новых синаптических везикул. Для этого нервно-мышечные синапсы дрозофил обрабатывали липофильной краской, которая связывается с мембранами нейронов и интернализуется в новые синаптические везикулы. Дефекта в этом процессе не наблюдалось при наличии нокаута по dSgip1. Нокаут также не влиял на рекрутинг везикул, на помещение в них нейротрансмиттеров и их высвобождение, а также на активацию постсинаптических рецепторов. Кроме того, при нокауте сохранялась общая белковая архитектура синапсов, что ученые показали, когда пометили различными метками известные синаптические белки.
Изучая структуру пресинаптических окончаний мушек с нокаутом по dSgip1 с помощью электронной микроскопии, исследователи обнаружили главное отличие между мутантами и дрозофилами дикого типа — у мутантов отсутствовали мультивезикулярные тельца. Это органеллы, которые присутствуют в специализированных клетках и образуются из складок мембран эндосом. Мультивезикулярные тельца содержат мембранные белки и цитоплазму, а позднее могут сливаться с лизосомами либо с плазматической мембраной, чтобы таким образом избавиться от своего содержимого. Тогда ученые пометили флуоресцентной меткой белок evi — мембранный белок, ассоциированный с мультивезикулярными тельцами. В синапсах мушек с нокаутом этот белок образовывал аномальные агрегаты, хотя экзосомы с ним все равно выбрасывались во внеклеточное пространство. Вместо мультивезикулярных телец ученые смогли обнаружить структуры, похожие на аутолизосомы, — в них и находился меченый белок evi. На основе этого исследователи заключили, что в норме dSgip1 регулирует слияние мультивезикулярных телец с мембраной и лизосомами, ингибируя первый вариант.
Мутации в исследуемом белке, по-видимому, приводят к одной из форм паркинсонизма, связанную с дефектами протеостаза в синапсах. Авторы работы рассчитывают, что обнаружение этой мутации улучшит диагностику, пригодится для генетического консультирования и лечения пациентов.
Транскриптом мозга при позднем начале болезни Паркинсона изменяется сильнее, чем при раннем