Нанопоровое секвенирование определяет разные типы метилирования бактериальной ДНК

Для изучения ДНК-метилирования млекопитающих широко применяется бисульфитное секвенирование, но для бактериального метилома оно малоэффективно. Ученые из США модифицировали метод нанопорового секвенирования для обнаружения трех основных типов метилирования ДНК бактерий — N6-метиладенина (6mA), N4-метилцитозина (4mC) и 5-метилцитозина (5mC), а также положения модифицированных оснований.

Метилирование у бактерий зависит от последовательности ДНК, или мотива метилирования. В среднем в одном геноме находятся мотивы трех типов, и практически каждый из них метилирован. Ученые проанализировали ДНК семи видов бактерий с различными мотивами и GC-составом. Согласно предыдущему исследованию, у этих видов 46 уникальных мотивов (28 для 6mA, 7 для 4mC и 11 для 5mC) и всего 308 773 сайта метилирования.

Исследователи провели нанопоровое секвенирование геномов этих бактерий на приборе MinION. Затем секвенировали те же последовательности, но после полногеномной амплификации (WGA), то есть без метилирования. Проанализировали различия между природной и WGA-ДНК, особенно в мотивах метилирования. Ученые показали, что полученные сигналы различаются в зависимости от мотива и типа метилирования. Сигналы от разных мотивов с одним типом метилирования схожи, как и сигналы от разных сайтов метилирования внутри одного мотива.

На основе полученных данных исследователи разработали модель для определения типа метилирования и местоположения метилированного нуклеотида. Модель «тренировали» на последовательностях с известными типом и положением метилирования. Эффективность метода подтвердили на ранее изученных геномах бактерий Nocardia otitidiscaviarum и Thermacetogenium phaeum.

После этого разработанным методом анализировали метагеном мыши. Результаты сравнивали с данными, полученными ранее методом одномолекулярного секвенирования в реальном времени (single molecule real time sequencing, SMRT). Паттерны метилирования, полученные двумя методами, были очень схожи, при этом нанопоровое секвенирование лучше определяло 5mC, а SMRT — 6mA. Новая модель позволила обнаружить 64 мотива (18 для 6mA и 46 для 5mC) и идентифицировать мобильные элементы благодаря их профилю метилирования. Обнадеживает, что было найдено так много 5mC, так как известно, что SMRT плохо их обнаруживает, а именно этот метод в настоящее время используют чаще всего для определения метилирования бактериальных геномов.

Авторы исследования предполагают, что паттерны метилирования, полученные благодаря их методу, можно будет использовать для выявления неверно собранных контигов и для более точного определения видов бактерий метабиома. Теоретически нанопоровым секвенированием можно определять не только ДНК-метилирование, но и другие виды ДНК- и РНК-модификаций.