Нанопоровое секвенирование выявляет миРНК, белки и малые молекулы в сыворотке крови

Биомаркеры сыворотки крови играют решающую роль в диагностике заболеваний, подборе лечения и мониторинге его эффективности. Аналиты, интересующие клиницистов, — белки, малые молекулы, в последнее время также микроРНК (миРНК). Выявление различных аналитов требует разнообразных подходов, что сказывается на стоимости анализов. Поэтому большой интерес вызывают мультиплексные методы анализа, позволяющие выявлять множество разнообразных аналитов в одном образце одновременно.

Исследователи из Имперского колледжа Лондона и компании Oxford Nanopore Technologies создали единую платформу для обнаружения аналитов различной природы с помощью нанопорового секвенирования специальных ДНК-зондов. Рабочий процесс построен на основе коммерчески доступного секвенатора MinION, обеспечивает получение результатов в течение одного часа; требуемый объем образца — менее 30 мкл.

При нанопоровом секвенировании отдельные молекулы ДНК или РНК сначала входят в поры на мембране под действием приложенного потенциала, а затем молекулу продвигает через пору моторный белок (хеликаза). При этом величина ионного тока через мембрану меняется по мере прохождения разных нуклеотидов сквозь пору; зависимость тока от времени позволяет восстановить последовательность нуклеотидов.

В предложенном авторами рабочем процессе каждый из зондов содержит адаптер, баркод и участок, связывающий аналит-мишень. Адаптерная область универсальна для всех зондов и включает моторный белок, контролирующий прохождение зонда через пору. Баркод — «подпись», прочтение которой позволяет идентифицировать аналит. Наконец, область связывания с мишенью — последовательность, комплементарная определенной микроРНК, либо аптамерная последовательность, которая избирательно взаимодействует с белком или малой молекулой.

Секвенирование начинается с адаптерной области, затем считывается баркод. Продвижение моторного белка по молекуле ДНК замедляется, когда он встречает препятствие на участке, с котором связан аналит. Это отражается на форме сигнала — в нем возникает пауза, которой не бывает при секвенировании свободного зонда. Плато на графике колебаний тока и указывает на присутствие мишени. Более того, рассчитав доли событий секвенирования с задержкой и без, можно оценить концентрацию аналитов в образце.

Авторы впервые продемонстрировали специфичное обнаружение микроРНК, разработав 40 зондов и инкубировав их с каждой микроРНК индивидуально. Потом образец секвенировали и события секвенирования сопоставляли с библиотекой зондов. В присутствии каждой из микроРНК-мишеней заметно увеличивался процент задержанных сигналов с соответствующего зонда. Затем 40 зондов инкубировали с 40 микроРНК-мишенями в различных концентрациях, и анализ также прошел успешно. Также авторы детектировали с помощью своей платформы комбинации микроРНК, белков и малых молекул (тромбин, натрийуретический пептид В-типа, тропонины, серотонин). Результаты обнаружения микроРНК в сыворотке крови людей соответствовали результатам ОТ-ПЦР.

Исследователи подчеркивают, что метод легко можно масштабировать для одновременного обнаружения еще большего количества аналитов, а также адаптировать для других биологических жидкостей, помимо крови, — слюны, мочи и спинномозговой жидкости.

В настоящее время при выполнении анализа крови необходимы этапы экстракции и амплификации, что увеличивает время тестирования и сопряжено с возможной потерей исследуемого вещества (например, из-за быстрой деградации РНК). Предложенная технология позволяет обнаруживать аналиты непосредственно в сыворотке крови, хотя нужна предварительная фильтрация, чтобы предотвратить закупорку пор крупными белками. Также предстоит оценить, насколько точно система сможет различать схожие последовательности микроРНК.

Созданы нанопоры из ДНК для детекции биомолекул