Нанотрубки передают сигналы на большие расстояния между кардиомиоцитами и клетками эндокарда в ходе формирования сердца

Формирование сердца при эмбриональном развитии начинается с двухслойной трубки, состоящей из клеток эндокарда и миокарда, которые разделены прослойкой аморфного матрикса с высоким содержанием гиалуроновой кислоты. Для нормального развития сердца требуется согласованная работа множества сигнальный путей. При этом рецепторы и их лиганды могут находиться в клетках по разные стороны слоя желеобразного вещества. Например, лиганды Notch Jag1 и Jag2 располагаются преимущественно на кардиомиоцитах, а их потенциальный рецептор Notch1 — преимущественно на клетках эндокарда. На вопрос, как именно осуществляется взаимодействие клеток через матрикс, ответили исследователи из Китая и США.

Взаимодействие лигандов и рецепторов на клетках эндокарда и миокарда ранее подтвердили при помощи генетически модифицированных мышиных эмбрионов с кардиомиоцитами, несущими на поверхности синтетический лиганд Notch — связанный с мембраной зеленый флуоресцентный белок (GFP), и клетками эндокарда, несущими синтетический рецептор Notch, внеклеточный домен которого заменен на нанотело к GFP, а внутриклеточный — на тетрациклиновый трансактиватор. Взаимодействие лиганда и рецептора можно регистрировать методом иммунофлуоресценции. Однако такой дизайн эксперимента не позволял ответить на вопрос, как осуществляется взаимодействие клеток, разделенных слоем матрикса.

В природе существует ограниченное количество механизмов отдаленного взаимодействия между клетками. Оно может осуществляться посредством диффузии сигнальных молекул либо с помощью межклеточных микроструктур. К последним относятся туннелирующие нанотрубки (у млекопитающих), филоподии (у мух) и цитонемы (у мух и позвоночных).

Авторы исследовали сердечные трубки эмбрионов мышей, находящихся на стадии 16 сомитов, с помощью конфокальной микроскопии (мембраны были мечены GFP). Они визуализировали выросты клеточных мембран кардиомиоцитов, направленные в сторону клеток эндокарда и проходящие через желеобразное вещество матрикса. Эти выросты были разделены на неконтактирующие нанотрубки, не достигающие клеток на противоположной стороне и сходные с филоподиями или цитонемами, и контактирующие нанотрубки, сходные с ранее описанными туннелирующими нанотрубками (TNT). Последние получили название TNT-подобных структур (TNTL).

Чтобы проверить роль TNTL в формировании камер сердца и Notch-сигналинге, исследователи культивировали клетки сердца генетически модифицированных мышиных эмбрионов, в которых при активации пути Notch в ядрах начинает экспрессироваться плазмида H2b-Venus, что позволяет детектировать функционирование этого сигнального каскада. Авторы продемонстрировали, что клетки эндокарда, не контактирующие с другими клетками в культуре, остаются H2b-Venus-негативными, а те из них, которые контактировали с другими клетками эндокарда или кардиомиоцитами посредством соприкосновения мембран либо через TNTL, начинали экспрессировать плазмиду. Таким образом, взаимодействие клеток с помощью секретируемых растворимых молекул не является достаточным для активации пути Notch, в то время как передача сигнала от кардиомиоцитов клеткам эндокарда с помощью TNTL запускает этот процесс.

Используя специальные молекулы-метки Tubulin Tracker Deep Red и LifeAct, связывающиеся соответственно с полимеризованным тубулином и актиновыми филаментами, ученые выяснили, что каркас TNTL составляют именно актиновые филаменты, но не микротрубочки. Используя методы криоэлектронной томографии и 3D-реконструкции, они визуализировали внутри TNTL структуры с морфологией актиновых филаментов, а также везикулы. Обработка клеток CK-666 (ингибитором сборки актиновых филаментов) нарушала формирование TNTL, что свидетельствует об основополагающей роли этих белков в формировании связей между клетками.

Для уточнения механизмов формирования TNTL авторы использовали линию мышей с нокаутированным геном Cdc42 (кодируемая им малая гуанозинтрифосфатаза участвует в сборке актиновых филаментов). Их эмбрионы не доживали до рождения, а количество TNTL между клетками миокарда и эндокарда у них было существенно ниже, чем в контрольной группе. В клетках эндокарда Cdc42-нокаутированных мышей по сравнению с контрольной группой было снижено содержание активной формы Notch1 (N1ICD), а содержание длинной неактивной формы Notch1 и транскриптов Notch1 было компенсаторно повышено. Культивирование этих клеток с кардиомиоцитами, несущими лиганды Notch и способными формировать TNTL, восстанавливало активность сигнального пути Notch (активность оценивали по экспрессии H2b-Venus).

Используя метод флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) для визуализации субклеточных процессов и аденовирусные векторы для доставки GFP-меток на лиганды Notch, ученые визуализировали транспорт везикул с лигандами от кардиомиоцитов к клеткам эндокарда.

Таким образом, используя разнообразные методы, от создания синтетических рецепторов и лигандов до 3D-визуализации, исследователи показали, что связь между пространственно разделенными кардиомиоцитами и эндокардиальными клетками в ходе эмбрионального развития поддерживается посредством нанотрубок. Транспортируемые таким образом лиганды Notch играют критическую роль в согласованном формировании структур сердца у млекопитающих. Дальнейшие исследования в этом направлении могут пролить свет на патогенез некоторых врожденных аномалий сердечно-сосудистой системы.