Нарушение сборки хроматина останавливает клеточный цикл по р53-зависимому пути

Точная репликация всего генома и правильное наследование организации хроматина с каждым клеточным делением необходимы для определения судьбы дочерних клеток и поддержания их идентичности. Ошибки сборки хроматина de novo во время репликации ДНК могут нарушать эти процессы. В ходе созревания хроматина гистоны и их варианты приобретают характерные для клетки посттрансляционные модификации, которые контролируют организацию хроматина и доступность ДНК, обеспечивая транскрипционную активность нужных генов. Важную роль в обеспечении правильной сборки хроматина de novo играет гистоновый шаперон CAF-1 (фактор сборки хроматина 1). Однако механизмы возникновения ранних дефектов при сборке хроматина и влияние CAF-1 на его организацию плохо изучены. Международная группа ученых исследовала последствия снижения уровня CAF-1 и установила молекулярные механизмы ответа на дефекты при сборке хроматина de novo в S-фазе клеточного цикла.

Авторы получили клеточные линии с модифицированным CAF-1 — к самой крупной его субъединице через N-конец пришили метку деградации, активируемую при взаимодействии с лигандом. Такая система обеспечивает полное разрушение CAF-1 уже через 10 минут после добавления лиганда. Это позволило ученым исследовать функции CAF-1 с высоким временным разрешением.

Ученые ввели лиганд за 10 минут до мечения EdU (аналогом тимидина) и затем провели EdU-секвенирование единичных клеток (scEdU-seq), что позволило отслеживать геномные изменения после клеточного деления. Наблюдалось снижение скорости репликации (скорости включения EdU) по всему геному на протяжении S-фазы, и этот эффект сильнее проявлялся в поздней S-фазе, когда реплицируются участки гетерохроматина. При этом сохранялось одинаковое количество репликативных вилок на клетку, но одновременно росла неоднородность скорости репликации на разных репликативных вилках.

С помощью микроскопии ученые наблюдали за ходом клеточного цикла по активности циклин-зависимой киназы CDK2. Оказалось, что резкая потеря CAF-1 в ранней или поздней S-фазе приводит к немедленному выходу активности CDK2 на плато, в то время как клетки, утратившие CAF-1 в G1-фазе, реагируют не сразу и нормальным образом наращивают активность CDK2, пока не войдут в S-фазу. Еще интереснее то, что в клетках, потерявших CAF-1 в G2-фазе, активность CDK2 не меняется до тех пор, пока произошедшие от них дочерние клетки не достигнут следующей S-фазы. Постепенное снижение активности CDK2 во всех лишенных CAF-1 клетках сохранялось до вступления в митоз. Соответственно, потеря CAF-1 замедляла скорость репликации ДНК, тем самым продлевая S-фазу и увеличивая продолжительность клеточного цикла.

Чтобы выяснить, как именно острое снижение уровня CAF-1 влияет на замедление репликации ДНК, ученые проанализировали активность контрольных точек клеточного цикла. Однако они не наблюдали увеличения уровней фосфорилирования CHK1, CHK2, H2AX, CDK1 или RPA. Ингибирование киназ ATR, ATM или Wee1, активирующихся в ответ на повреждения ДНК, не компенсировало падение интенсивности EdU, которое наблюдалось при снижении уровня CAF-1. Авторы заключили, что острое снижение уровня CAF-1 приводит к быстрому падению скорости репликации ДНК через механизм, отличный от канонического сигналинга о повреждении ДНК. Потенциальным специфическим маркером нарушений сборки хроматина в S-фазе может быть накопление PCNA (ядерного антигена пролиферирующих клеток).

Авторы провели анализ scVASA-seq, который позволяет секвенировать всю РНК единичных клеток, включая неполиаденилированные транскрипты, к которым относятся в том числе транскрипты гистонов. Они показали, что транскрипционные профили клеток после кратковременного (2 часа) снижения уровня CAF-1 изменяются только в S-фазе, а более длительное (30 часов) снижение уровня CAF-1 вызывает транскрипционные изменения и в других фазах, что говорит о более сильном влиянии на клеточный цикл. Углубленное изучение клеток в S-фазе после кратковременной потери CAF-1 выявило снижение уровня транскрипции специфичных для S-фазы гистонов. Кроме того, были обнаружены изменения в представленности различных гистонов и их вариантов, а также их посттрансляционных модификациях, что приводит к нарушению и задержке созревания хроматина.

Методом repli-ATAC-seq, который позволяет измерять доступность хроматина именно в реплицирующихся участках ДНК, ученые установили, что острое снижение уровня CAF-1 значительно увеличивает доступность вновь реплицирующейся ДНК по всему геному, и это приводит к потере точности транскрипции в S-фазе.

Кроме того, снижение уровня CAF-1 подавляет способность клеток вступать в новый клеточный цикл после митоза. Этот эффект был более выражен для клеток, которые потеряли CAF-1 на ранних фазах клеточного цикла, и чем дольше отсутствовал CAF-1, тем меньше они были способны к дальнейшим делениям. Соответственно, чтобы войти в G0-остановку клеточного цикла, клетка должна пройти полную S-фазу с дефектной сборкой хроматина de novo. Авторы также показали, что остановку клеточного цикла в фазе G0 при потере CAF-1 контролирует р53. Об этом свидетельствует то, что клетки с нокаутом р53 не останавливаются на G0 после прохождения одной S-фазы с дефектом сборки хроматина de novo.

Таким образом, потеря CAF-1 немедленно снижает скорость репликации и значительно увеличивает доступность вновь синтезируемой ДНК. Запускается клеточная стрессовая реакция, которая отличается от канонического сигналинга о повреждении ДНК. Изменение состава гистонов и их вариантов, а также пострансляционных модификаций нарушает точность транскрипции и замедляет созревание хроматина в S-фазе. Это приводит к р53-зависимой остановке клеточного цикла после митоза.

Для формирования веретена деления необходим белок FAM110A